交通大學生物科技系所學位論文
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要維持生物細胞功能正常運作，細胞中的氧化劑及抗氧化劑的平衡作用是不可或缺的。一般來說，在自然的情況下，細胞會有相對應的防禦機制將氧化劑還原並維持體內氧化鈦平衡。當細胞因為自然因素或是外在因素致使細胞內產生額外的氧化劑，且防禦機制無法平衡時，過多的氧化劑與細胞中的各物質發生交互作用並造成氧化傷害，即氧化壓力(oxidative stress)；關於氧化壓力及其所造城的傷害在近年來已經被證實與老化與多種疾病有關。在本文中，提出以光學比率測量原理為基礎的奈米生物感測粒子[PEBBLE (probes encapsulated by biologically localized embedding) nanosensor]。粒子中含有過氧化還原酵素－catalase (EC 1.11.1.6)以及兩種螢光染劑－Ru(II)-tris(4,7-diphenyl-1,10-phenanthroline) chloride ([Ru(dpp)3]2+)和Oregon Green 488-dextran。並使用sol-gel技術將上述物質包覆於例子中以用於偵測體內過氧化氫濃度。此光學比率測量奈米生物感測粒子粒子為圓球體，平均尺寸約為200±50nm，並具有約8U/mg的catalase活性。Catalase可以將細胞中造成氧化壓力的過氧化氫還原生成氧氣。同時，粒子中的[Ru(dpp)3]2+的螢光訊號會因為氧氣的存在而產生quenching，造成螢光強度的改變；而相反的Oregon Green 488-dextran之螢光訊號則不受氧氣濃度影響，可作為測量的基準值，與[Ru(dpp)3]2+訊號相較以提供細胞內過氧化氫偵測資訊。
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白色念珠菌為人類重要的伺機性病源菌。先前本實驗室利用抑制刪除雜交法 ( Suppression Subtractive Hybridization , SSH ) 經過定序後的分析比對，得到在野生株 ( SC5314 ) 與失去致病力的efg1/efg1 cph1/cph1 雙基因突變株 ( HLC54 ) 兩者之間表現量有差異的基因。其中有一個是醣解作用中的基因CaGPM1。利用北方墨點法分析，結果顯示CaGPM1基因在efg1/efg1 cph1/cph1雙突變株的表現量大於野生株。此外，在篩選影響抗藥性表現的基因時，發現CaGPM1的表現受CaNDT80之影響，因此本實驗研究目標想要了解醣解酵素基因 CaGPM1與細胞型態及抗藥性是否有關系。 首先利用同源重組置換方式將CaGPM1基因剔除並且將CaGPM1單套基因重新置入Cagpm1/Cagpm1雙套基因破壞株進行基因補救，接著進行這些突變株之特性描述，分析其與型態及抗藥性，結果顯示於Etest試驗Cagpm1/Cagpm1雙套基因破壞株中對於caspofungin、amphotericin B兩種藥物的敏感具有提高現象，Cagpm1/Cagpm1雙套基因破壞株影響初期的芽管形成，長菌絲型態介於野生株SC5314與失去致病力HLC54之間，Cagpm1/Cagpm1雙套基因破壞株在固態YPGE/uridine 培基上，細胞菌落小，細胞生長緩慢，因此證實CaGPM1與藥物敏感性、型態變化有所相關並且會影響細胞生長。
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登革熱目前已成為一個全球性健康的議題，主要分布在熱帶及亞熱帶地區。目前統計超過一百個國家曾經爆發過登革熱疫情並且大約有二十五億的人口受到登革熱病毒的威脅。因此目前針對登革熱疫苗的研發，治療和預防的方法也是一個迫切的議題。 在登革熱病毒產生蛋白質的過程，會先產生單一個蛋白質轉譯區，再切割成十個獨立的蛋白質。其中，NS2A、NS2B、NS4A及NS4B是較小的非結構型蛋白，具有疏水的特性。這四種蛋白質中，只有NS2B已知會參與蛋白切割反應，而NS2A、NS4A、及NS4B尚未被鑑定出確切的生化功能。為研究登革熱病毒此四蛋白質的結構及功能，本研究嘗試將四種蛋白質在哺乳類細胞中以加上EGFP (enhanced green fluorescence protein)的融合蛋白(fusion protein)形式表現。成功篩選出NS2A及NS2B穩定轉植細胞株後，溶斑試驗(plaque assay)的結果顯示:表現NS2A的穩定轉植細胞株經登革熱病毒感染後，相較於對照組會減少44%的溶斑數 (P <0.05)。 另外先前實驗室已經篩選出某些以四環結構為主體的四環黴素衍生物，其可與外膜蛋白上的β-OG pocket docking，也對登革熱二型病毒有初步的抑制效果。因此我將進一步利用溶斑試驗測試這些四環黴素衍生物針對登革熱病毒二型PL046病毒株及三型H87病毒株的抑制是否有strain specificity的效果。結果顯示，在溶斑試驗當中四環黴素衍生物對於登革熱病毒二型和三型的溶斑生成確實是有抑制的效果，其中又以doxycycline和chlortetracycline抑制的效果最為顯著。而進一步的比較發現，針對登革熱病毒二型的抑制能力比三型的抑制能力高。
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實驗室先前在 C. tropicalis 臨床菌株的 5-flucytosine (5-FC) 感受性測試中分離到抗藥衍生株。根據前人研究，破壞 pyrimidine 生合成途徑任何一個蛋白質，或是影響其調控都會導致 5-FC 抗藥性。於是將 parental strain 與其抗藥衍生株進行相關抗藥基因 FCY1、FCY2、FUR1 和 URA3 序列分析，發現有些 parental strains 的 FCY2 為異質合子型，但其抗藥衍生株卻變成同質合子型。因此更進一步以 SAT1 flipper 建構 FCY2 同質合子置換株及單股缺陷突變株，並證實失去異質合子性與 5-FC 抗藥性發生有關。但 FCY2 失去異質合子性所造成的 5-FC 抗藥有兩個可能原因，第一， Fcy2p 第 91 個胺基酸由 Met 變為 Ile；第二，promoter 序列的變異使 FCY2 mRNA 表現量下降。 本研究第二部分與排藥幫浦 CDR1 相關，文獻指出其大量表現與 azoles 抗藥性相關，然而其調控機制目前瞭解並不多。實驗室先前於 C. albicans genomic DNA library 中篩選到 CaNDT80 為 CDR1 可能的正向轉錄因子。經由序列比對CaNDT80 與 S. cerevisiae 的 ScNDT80 為同源基因，它們的DNA結合區有 35％ 相同度和 53％ 相似度，有趣的是活化區卻沒有任何相似性，這是一段全新的序列，沒有人研究過它的功能。因此利用 error-prone PCR 在 CaNDT80 活化區產生隨機突變，建構成一個 library，想要找出哪些胺基酸對於調控 CDR1 扮演重要的角色。為了達到這個目標，於是分別建構了以 chloramphenicol 及 kanamycin 為報導基因的篩選性質體的 clones，用來剔除 library 中帶有 nonsense 及 frameshift mutations 的 clones，以利日後的研究。初步測試顯示於適當濃度的抗生素培養基中，此二質體均具有篩選功能，可作為之後的應用。
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對世界各地的幼童而言腸病毒七十一型 (Enterovirus 71, EV71)是一種重要的致病原且比其他非小兒麻痺腸病毒 (non-polio enterovirus)具有高致病率及致死率，其感染屬於神經性症狀，且平均會在三天內惡化。傳統的臨床確認檢驗方式需要先病毒培養再進行病毒分離 (virus isolation)和藉由反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)，這些過程耗時、昂貴且無法達到立即診斷EV71。在文獻中，多晶矽奈米線場效電晶 (polysilicon nanowire field-effect transistor, poly SiNW- FET)可被製成且具有高靈敏度、無標誌且立即偵測腸病毒七十一型的置能轉換器 (transducer)。對特定EV71的DNA序列有專一性的單股DNA序列先被固定在多晶矽奈米線場效電晶體表面，用來偵測EV71的多晶矽奈米線場效電晶體具有高靈敏度，且能對EV71產生反應，並且在有無交互作用的離子分子下仍是穩定的，最低可偵測到aM (attomolar, aM,10-18M)範圍。此結果表示多晶矽奈米線場線電晶體具有靈敏、無標誌且可立即偵測的淺能，此特性可發展成生物感測系統用來偵測EV71的感染，以便早期發現早期治療，
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宿主的健康狀態與其腸道菌相有極為密切的關係，以益生菌來預防及治療腸胃道感染性或免疫性疾病已行之有年且已被許多研究證實其效果。不同商品化的益生菌對感染性疾病的預防有不同程度的效益，但以益生菌增補來達到預防腸胃道疾病的目標是可以確定的。益生菌是如何達到幫助宿主減少罹患腸胃道感染性或免疫性疾病之機制至今仍不清楚。可能是經由刺激宿主特異性與非特異性的免疫能力；或是益生菌自己合成一些抗菌物質，與病原菌競爭營養源，甚或抑制病原菌附著及侵入宿主之黏膜上皮組織等方式來達成。本實驗之目的在於探討不同Lactobacillus strains在宿主腸胃道疾病預防或治療上所扮演之功能性角色。首先，藉由比較長期增補三種不同市售益生菌產品對宿主感染性疾病影響之研究顯示：長期增補L. rhamnosus T cell-1對於預防病毒性感染有顯著成效；以混合多種/株乳酸菌之益生菌製品，則對小兒腸胃道疾病有極佳之預防效果。L. casei rhamnosus不論對小兒病毒性、細菌性、腸胃道感染或呼吸道感染性疾病的預防效果都最為顯著。我們以臨床成效最佳之L. casei rhamnosus 為主要研究菌種，探討以之對抗宿主病原細菌之可能機制。將L. casei rhamnosus分別與E. Coli ATCC25922、Bacteroides fragilis及C. difficile等不同腸道致病菌死菌共培養，結果發現在不同腸道致病菌存在下，L. casei rhamnosus抗菌能力並不受腸道致病菌誘導而發生改變，顯示L. casei rhamnosus在不需病原菌共同存在下即可分泌抗菌物質達成抗菌之效益。最後，我們亦證明L. casei rhamnosus預防或治療腸胃道發炎性疾病之可能性。L. casei rhamnosus可分泌具熱穩定性之促細胞凋亡因子 (LcrS5-30)，分子量介於5-30 kDa。此胞外因子LcrS5-30可特異性誘導淋巴球或單核球以粒線體凋亡途徑進行凋亡，卻不會誘導腸黏膜上皮細胞發生凋亡。以脂多醣刺激淋巴球或單核球，在LcrS5-30存在下可有效抑制發炎細胞激素的產生，有趣的是LcrS5-30亦可同時誘導抗發炎細胞激素β1轉化生長因子之分泌，而此β1轉化生長因子之分泌並非誘導免疫細胞凋亡的主因，顯示細胞凋亡的效應乃由LcrS5-30所促成。
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在近年來，樹突細胞相關的抗癌疫苗(Dendritic cell (DC)-based antitumor vaccine)被視為很具發展潛力的癌症免疫治療方式。然而，在臨床的實行上只有某部分的病人在經過樹突細胞疫苗治療後有出現明顯腫瘤消退的現象。其中一個可能的解釋是很多惡性腫瘤可能會透過分泌免疫抑制的因子，像TGF-β1，的方式透過抑制宿主的免疫反應來限制樹突細胞疫苗的效力。在此研究中，我們展現了同時地將免疫調節相關的基因傳遞進細胞中並融合細胞可以提升樹突細胞融合疫苗的效力。 在本研究中，IL-6 因為具有拮抗TGF-β1 的免疫抑制活性的能力，被拿來作為實驗中的轉殖基因。此外，LPPC (Lipo-PEI-PEG Complex)，我們實驗室所開發的創新帶正電微脂體，在同時融合與轉染的過程中扮演轉染劑的角色。結果顯示，LPPC 的加入不會影響PEG 的融合效率而且同時地IL-6 轉殖基因也成功地被LPPC 帶入細胞。一致地，接種LPPC/IL-6/PEG 樹突細胞融合疫苗的動物引發出較佳的免疫反應。因此，我們認為此製作疫苗的策略具有在臨床應用上提升基因改良的樹突細胞融合疫苗的應用潛能。
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胃幽門螺旋桿菌的熱休克蛋白 (HSP60s) 誘導前發炎性細胞激素(proinflammaroty cytokine) 的表現跟胃部發炎有很大的關連性。在臨床的研究中，胃幽門螺旋桿菌感染病人的血清裡可以偵測到抗胃幽門螺旋桿菌熱休克蛋白60抗體。令人感到驚訝的，16位患有胃癌、胃炎、十二指腸潰瘍或胃潰瘍病人的血清並無法中和重組胃幽門螺旋桿菌熱休克蛋白60 誘導腫瘤壞死因子-甲型 (TNF-alpha) 和介白素-8 (IL-8) 的釋放，反而增加前發炎性細胞激素的表現。研究結果顯示，不論來自何種物種的抗胃幽門螺旋桿菌熱休克蛋白60多株抗體 (anti-HpHSP60 polysera) 都可以影響胃幽門螺旋桿菌熱休克蛋白60增加腫瘤壞死因子-甲型和介白素-8的表現。更近一步研究發現此增強效應為血清中專一抗胃幽門螺旋桿菌熱休克蛋白60抗體所導致，而非血清中其他因子或非專一性抗體。最後，實驗結果推測Fc接受器 (Fc receptor) 在抗胃幽門螺旋桿菌熱休克蛋白60抗體增加發炎的影響中扮演一個角色。綜合這些研究結果，我們揭露當胃幽門螺旋桿菌熱休克蛋白60存在時，病人血清中的抗胃幽門螺旋桿菌熱休克蛋白60抗體可能造成更嚴重的發炎。這樣的發現可能可以提供未來胃幽門螺旋桿菌感染病人在臨床上治療的應用。
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現今奈米生物科技是個很熱門的研究領域，主要是因為當某材料的空間中尺寸達到100 nm以下時，其物理及化學特性相較於一般塊材會有所改變，而奈米鑽石也不例外。早期的奈米鑽石多用於機械上的工業加工或是表面處理，但有近來之研究發現奈米鑽石具有螢光特性，可當作生物分子的追蹤器(bio-tracer)；並有其他文獻指出奈米鑽石不具有細胞毒性且能進行表面官能基的修飾，因此奈米鑽石更具有跨足生醫領域的潛能。而奈米鑽石在吸收奈秒脈衝雷射能量後，其內部的官能基會由-C-N=O裂解成-C ﹢N≡O，更近一步來說，也就是奈米鑽石吸收了能量產生了熱聲子效應，使得鑽石間的軌域由鑽石的核心結構sp3轉變成石墨的結構sp2就由如爆炸一般。因此利用奈米鑽石吸收能量具有爆炸的特性，且結合一生長激素蛋白，使具有大量表現生長激素受體的癌症細胞與奈米鑽石-生長激素附合體結合，再搭配雷射能量系統使得奈米鑽石爆炸，並隨後引發一連串的細胞凋亡反應。而本實驗利用聲子所引起的奈米級爆炸，猶如奈米刀般應用在奈米級生物醫學治療上。
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奈米金球（gold nanoparticles, AuNPs）具有獨特的物理特性，並且在光學上具有表面電漿共振吸收（surface plasmon resonance, SPR）的現象而備受注目。由於奈米金球的吸收光譜會因大小、形狀，或表面修飾上有機分子而有所差異，因此本研究利用AuNPs之SPR特性，建構出一光學式生物感測平台用於蛋白質酶（proteinase）活性之檢測。 本研究首先將明膠（gelatin）修飾於13 nm的AuNPs上作為proteinase之受質，同時修飾上6-醯基己-1-醇（6-mercapto-1-hexanol, MCH）當作誘導子。當AuNPs修飾上gelatin與MCH時，gelatin所造成的空間障礙可防止金球彼此間的距離拉近，避免AuNPs產生聚集。因此AuNPs/MCH-gelatin可穩定存在於極端的檢測環境中。當proteinase中的胰蛋白酶（trypsin）或基質金屬蛋白質酶-2（matrix metalloproteinase-2, MMP-2）降解AuNPs/MCH-gelatin表面上的受質後，AuNPs失去保護，同時MCH增強AuNPs彼此間的吸引力，AuNPs彼此間距離逐漸靠近，因而產生聚集。AuNPs聚集時，其SPR會有紅位移（red-shift）現象，並且AuNPs的呈色會由原先的酒紅色轉變為紫色。此外，AuNPs之顏色變化可直接以肉眼觀察，且最大吸收波峰值（λmax）可經由UV/Vis spectroscopy量測之。 在此以奈米金球為基礎的光學式生物感測平台中，利用AuNPs的吸光值比值（A625 nm/A525 nm）估計proteinase之活性，針對trypsin之偵測線性範圍為5 × 10-1至5 × 102 U，偵測極限為5 × 10-1 U；而針對MMP-2測得的線性範圍為50 ng/mL到600 ng/mL，偵測極限為50 ng/mL。此外利用兩種MMP-2抑制劑，galardin及ONO-4817進行藥物篩檢方面研究。利用此奈米金球系統針對galardin及ONO-48進行檢測，其IC50值分別為1.87 nM 以及17.76 nM，而以酶譜分析法（zymography）所測得之IC50值分別為3.48與14.33 nM，結果顯示此兩種方式所測得之結果有高度一致性。然而此光學式生物感測系統可將偵測時間縮短到30分鐘內。因此，此快速且敏感性高的奈米金球光學生物感測平台具有相當潛力運用於anti-MMPs藥物篩檢及MMPs相關疾病診斷上。