交通大學生物科技系所學位論文
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人類3-巰基丙酮酸硫轉移酶(human 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase, h-MST)能夠緩解人體內的氰中毒，解毒過程包括過硫鍵的生成以及後續的脫硫反應(dethiolation)。在過硫鍵生成的步驟中，3-巰基丙酮酸(3-mercaptopyruvate, 3-MP)上的硫原子轉移到h-MST上的半胱胺酸248殘基(Cys248)上，形成過硫化的Cys248與丙酮酸(pyruvate)。本研究著重探討脫硫反應，首先建構小尺度的CG模型來進行模擬。CG模型是由半胱胺酸─甘胺酸雙肽再加上氰離子(CN-)所構成，並使用密度泛函理論(density functional theory, DFT)及Møller-Plesset 二階微擾理論(the second order Møller-Plesset perturbation theory, MP2)進行結構最佳化及建立反應位能面；而氰離子在這個模型中與過硫化的Cys248反應，經過兩步驟的途徑生成較無毒性的硫氰根離子(SCN-)：分別為第一步驟的過硫鍵斷裂，以及第二步驟的質子轉移。在B3LYP/6-311++G(d,p)計算下得到的第一及第二活化能，分別是55.5 kcal/mol及40.1 kcal/mol；而在MP2的計算下則是55.0 kcal/mol及45.7 kcal/mol。此外，在真實蛋白質系統(PDB code: 4JGT)中則使用兩層的ONIOM計算法進行探討，模擬結果顯示，反應中僅有一個過渡態，脫硫機制為一步驟反應。在ONIOM(B3LYP:AMBER)下計算得到的活化能為45.6 kcal/mol，而在ONIOM(MP2:AMBER)下得到的活化能，則提高至58.4 kcal/mol。綜上所述，我們認為在CG模型與蛋白質系統計算得到的高活化能，暗示了雖然人體中存在h-MST可以幫助解毒，但發生氰中毒時仍會致死的原因。
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白色念珠菌(Candida albicans)是一種伺機性的病源真菌，通常會共生於人體當中，但是當宿主的免疫功能低下時，白色念珠菌就會開始增生並引起局部性或系統性的感染。白色念珠菌可以在酵母菌型和菌絲型之間轉換，而目前知道這型態之間的轉換是受到轉錄因子CaEfg1p和/或CaCph1p所調控。若將CaCph1和CaEfg1進行剔除後，白色念珠菌將會失去形成菌絲的能力而維持酵母菌型，並對於小鼠的毒性和致病力大幅下降。這表示白色念珠菌的型態轉變對於致病機制相當重要。 在比較CaEfg1p和/或CaCph1p基因表達模式，挑選表現量有差異的基因後，本研究中挑選的三個基因CaHGT6、CaORF19.7566和CaCDR4是表現量有差異的基因，而這些基因可能和菌絲生長或致病力有所關聯。又因這三個基因可能為轉運蛋白，因此本研究亦測定生長情況。藉由利用SAT1 flipper cassette 建構出三基因的雙套剔除株，並進行型態變化和生長曲線的測試。在結果中，型態相關的芽管生成、菌絲生成和侵犯力實驗，三個基因的雙套剔除株和野生株並無明顯差異，而在生長相關的測定中，三個基因的雙套剔除株和野生株也並無明顯差異。
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如同其他致病細菌，克雷白氏肺炎桿菌在宿主環境中需要克服缺鐵的考驗。克雷白氏肺炎桿菌的二價鐵的螯合系統基因組feoABC、sitABCD和efeUOB在含鐵量豐富的培養條件中，會受轉錄因子Fur抑制其表現。本研究以克雷白氏肺炎桿菌CG43S3為親本株分別建構了∆feoA、∆feoC、∆feoA∆fur、∆feoB∆fur、∆feoC∆fur、∆sitCD、∆sitCD∆fur、∆efeUOB、∆efeUOB∆fur、∆feoB∆sitCD、∆feoB∆efeUOB、∆sitCD∆efeUOB、∆efeUOB∆sitCD∆feoB和∆efeUOB∆sitCD∆feoB∆fur等基因缺損突變株，並比較分析這些基因缺損後對生長及致病性相關的表現型之影響；同時，這三套螯鐵系統預測的啟動子片段也被轉殖至啟動子報導質體placZ15中，再藉由β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）活性評估其基因表現。結果顯示這三套螯鐵系統的啟動子活性皆可因fur基因缺損或缺鐵環境所誘導；在缺鐵、微氧條件下，feo的啟動子活性會被FeoC負向調控；而sitABCD活性最高。SitABCD系統能幫助細菌對抗氧化壓力；而sit及feo基因都剔除結果會使細菌的抗氧化能力明顯下降；EfeUOB表現可受酸性誘導，並被雙分子訊息系統的反應蛋白CpxR負向調控，此結果顯示EfeUOB可能在有氧、缺鐵及弱酸的特定環境中扮演重要角色。莢膜多醣體的生成與鐵的多寡有關，然而FeoABC、SitABCD或EfeUOB基因剔除並不影響克雷白氏肺炎桿菌CG43的莢膜多醣體產生；而除了∆sitCD∆efeU和∆feoC之外，其他的基因缺損株都會降低生物膜的生成，在添加了三價鐵螯合劑Deferoxamine後，這些缺損株的生物膜減少更為顯著；有趣的是，受鐵濃度影響表現、而且是決定生物膜生成的主要因子第三型線毛，其主要單位蛋白MrkA並沒有受到這些基因缺損的影響，這結果暗示這些螯鐵系統並不是透過影響MrkA表現來影響生物膜的生成。
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胃酸是對抗經口而入人體病原菌的第一道防線，在這極酸的環境下，腸道菌具有特定抗酸機制來抵禦胃酸的傷害。大腸桿菌HdeA、HdeB座落在抗酸島嶼上，當面臨酸壓力時HdeA、HdeB在膜間質執行伴隨蛋白功能保護受質蛋白質不受到酸傷害。克雷白氏肺炎桿菌CG43具有兩套抗酸島嶼AFI-I和AFI-II，有趣的是，AFI-II在NTUH-K2044和MGH78578並不存在。AFI-I上有hdeDB、hdeB1、yfdX和kvhAS；AFI-II上有hdeA、hdeD1B2、kvgAS和kvgA1S1。先前研究指出這些基因缺損株的抗酸能力依序為ΔhdeB1>ΔhdeD>ΔyfdX>ΔhdeB；重組蛋白HdeB與YfdX皆具伴隨蛋白活性；AFI-I上的基因會受到弱酸誘導，yfdX的表現量在靜置培養下會受RcsB調控。本研究建構了hdeA及hdeB2D1基因缺損株，其抗酸能力依序為ΔhdeB1>ΔhdeD>ΔhdeB>ΔhdeB2D1，hdeA基因缺損只有在穩定生長期對細菌的抗酸能力有明顯影響；此外，在yfdX、hdeB、hdeDhdeD1或rcsB基因缺損株中增加HdeA表現皆可回補其抗酸能力，但當HdeA與受質結合的44苯丙氨酸點突變後後即無法增加細菌抗酸能力，顯示HdeA具很強的伴隨蛋白活性，且第44個胺基酸對於其伴隨蛋白活性是很重要的。最後，PhdeA或PhdeB2D1活性不會受到弱酸誘導，在震盪培養或靜置培養下rcsB和rpoS的基因缺失皆不影響PhdeA和PhdeB2D1的活性。
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抗穆勒氏荷爾蒙(Anti-Mullerian hormone)，簡稱AMH，又名為穆勒氏抑制物質(Mullerian inhibiting substance, MIS)，是轉化生長因子-家族(TGF-family)的一員。在婦女妊娠期(gestation) 7週時，可於男性胎兒血液中發現AMH，此時的AMH是由塞托利氏細胞(Sertoli cell)所分泌，分泌的AMH會與AMH receptor結合並抑制穆勒氏管的演化，導致無法發育形成子宮。在女性胎兒，AMH可於妊娠期36週時被偵測到，此時的AMH是被前有腔濾泡(preantral)的顆粒性細胞(granulosa cell)所分泌。另外，婦女體內的AMH濃度可顯示其卵巢儲備量，因此於生殖醫學鑑定方面，AMH已被廣泛應用於評估是否適合進行人工催卵，但目前之檢測方式的穩定性與檢測時間均有待加強。又電化學阻抗譜儀，簡稱EIS，其利用交流信號提供用於檢測的少量生物分子的信息。在我們的實驗室中，我們建立了一個簡單，快速，可靠，靈敏的生物感測檢測平台，以量化大腸桿菌71型(Enterovirus 71, EV71)，血紅蛋白(Hemoglobin)與血紅素結合蛋白(Haptoglobin)的濃度，並在本研究中，我們運用已有之技術平台創建了一個具AMH專一性的探針以進行AMH快速檢測及定量，從樣品浸泡以及電化學頻譜儀偵測的時間僅需約18分鐘，並可與傳統的酵素免疫分析法ELISA進行比較。這會是一個快速AMH檢測平台並可用來量化婦女血清中的AMH。
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微藻養殖可用於廢氣中二氧化碳（CO2）的減量，以及廢氣中部份有毒氣體的減除，而所養殖的微藻細胞中油脂則可被萃取與轉化為生質柴油，據此微藻養殖同時具備有減碳、減廢、生產生物質能等多重效應。本研究中，我們利用化學突變處理與馴養方式，分離得到可分別耐受工業廢氣與畜牧沼氣之微藻Chlorella sp.突變株，並探討通入不同種類的工業廢氣和畜牧沼氣用於微藻養殖對其生長效能，生物質和油脂產量，以及油脂組成的影響。此外，我們也建構了一戶外型的光生物微藻養殖模組，搭配自動氣體切換操作程序，探討戶外實場大規模微藻養殖用以沼氣提純(upgrading)和工業廢氣中CO2減量的效能。 在利用工業廢氣的研究中，Chlorella sp. MTF-15微藻株和中國鋼鐵公司煙道氣被用於各項實驗。煙道氣來源有三種，分別為煉焦爐（主要組成23-27% CO2、70-80 ppm NOX及80-90 ppm SO2）、高爐（24-28% CO2、8-10 ppm NOX及15-20 ppm SO2）及動力場（22-26% CO2、25-30 ppm NOX及15-20 ppm SO2），以這三種工業廢氣進行室內Chlorella sp. MTF-15養殖時，微藻具有相似的生長趨勢，而在通入廢氣與空氣混合稀釋比例約1/4或1/2時，微藻具有較高的生長潛能。Chlorella sp. MTF-15通入煉焦爐、高爐及動力場工業廢氣養殖後，其最大比生長速率與油脂產量分別為0.827、0.762及0.728 d-1與0.668、0.961及0.792 g/L，通入工業廢氣養殖之微藻的C16:0 + C18:1（適合用於生產生質柴油之脂肪酸）含量約為60-65%，其中通入動力場廢氣所養殖之微藻的C18:1含量明顯高於通入煉焦爐與高爐工業廢氣者。Chlorella sp. MTF-15對於煉焦爐、高爐及動力場廢氣中CO2的最佳移除效率分別約為25%、40%及50%；對於煉焦爐廢氣中NOX與SO2的移除效率約為65%與40%，對於高爐與動力場廢氣中NOX與SO2的移除效率為> 80%與> 90%。上述結果顯示，微藻Chlorella sp. MTF-15的生長潛能、油脂產量及脂肪酸組成取決於工業廢氣中的主要氣體組成和微藻養殖模組的操作模式，例如工業廢氣的稀釋比例。 在利用畜牧沼氣中CO2之研究中，由於畜牧廢水經厭氧發酵處理後除了產生含有高濃度甲烷（CH4）之沼氣外，也常伴隨著大量的惰性氣體CO2的產生，因此若要有效的將沼氣應用在引擎燃料上，勢必要先降低沼氣中CO2的濃度以提升沼氣中CH4的濃度。為了使微藻於沼氣中仍保有其生長潛能，我們分離篩選得一株可耐受沼氣之微藻突變株Chlorella sp. MB-9。Chlorella sp. MB-9在通有H2S < 100 ppm和80% CH4的環境之下，相較對照組仍具有70%以上的生長潛能。在實場的戶外操作實驗中，通入分別為0.05、0.1、0.2及0.3 vvm流量之除硫沼氣（~20% CO2、~70% CH4及H2S < 50 ppm），Chlorella sp. MB-9的最高生長率分別為0.320、0.311、0.275及0.251 g/L/d。為了提純沼氣，我們利用所建立的戶外光生物微藻養殖模組，搭配了自動氣體切換程序用於實場微藻養殖試驗，而結果顯示沼氣中的CO2之移除效率能持續維持在50%以上，而CH4的濃度從起始的70%提升至85-90%。 綜上所述，我們的實驗結果證實Chlorella sp. MTF-15與MB-9能直接並有效地利用不同的工業廢氣或畜牧沼氣中的CO2，以作為微藻生長的營養源並生產生物質與脂質。此外，我們所建立之噸級規模的具有自動氣體切換操作功能的戶外光生物反應系統，能有效率地作為一連續式的工業廢氣的生物移除或沼氣提純之CO2捕捉的微藻養殖模組系統。這些結果皆證實了利用微藻進行生物固碳是一個具有潛力的方法，不僅能有效的用來減除工業廢氣中CO2的排放、提升沼氣中CH4的濃度，還能生產富含油脂之微藻生物質作為再生能源的料源。
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Enolase（2-phospho-D-glycerate hydrolase）是一個組成醣解途徑的酵素，在演化過程中具有高度保留性，在Candida albicans中，它是ENO1的基因產物。此基因（CaENO1）的表現受到調控致病力的EFG1的影響。因此，本研究利用SAT1 cassette進行基因剔除以了解CaENO1的相關功能，發現葡萄糖或果糖會抑制Caeno1/Caeno1同基因合子突變株的生長及發芽管之形成，突變株也無法在不含胺基酸的Difco-yeast nitrogen base培養基中生長。在相關的藥物感受性試驗中發現，Caeno1/Caeno1雙套基因突變株影響amphotericin B、miconazole和NaCl的感受性。因此CaENO1除了醣類代謝的機制，也涉及發芽管形成、藥物感受性與細胞間的離子滲透；另外，在小鼠體內試驗結果發現突變株失去致病力，這些研究結果將可能有助於於開創新一代的抗真菌製劑。 另外，先前實驗室經由在啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）所進行的library screening發現在啤酒酵母菌中CaREP5（Regulator of Efflux Pump）和CaREP6能增加CDR1p-lacZ的β-galactosidase酵素活性。CDR1是一個抗藥基因，先前報導指出它也跟CaENO1一樣，涉及白色念珠菌的致病機制。本研究主要在白色念珠菌中針對CaREP5和CaREP6的基因遺傳學和功能性探討，希望藉此進一步了解抗藥性的調控機制。結果在測試的條件下，null突變株的表現型並無顯著改變。
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本論文第一部分敘述將帶有C型肝炎病毒核心蛋白抗原片段的重組質體轉型入高突變性的大腸菌株，經過數代培養，藉以篩選具高抗原性的核心蛋白突變株，再量化此突變蛋白作為檢測抗原，期能提高現行偵測C型肝炎病毒抗體的零敏度。首先，將帶有核心抗原基因片段（1至123胺基酸）質體pET-Wt轉型至具高突變性的大腸桿菌XL1-Red，經10次繼代培養後抽取質體轉型至大腸桿菌BL21(DE3)，挑選616個單一菌落分別培養後以C型肝炎患者血清中多株抗體進行免疫分析後，篩選得到對抗體之反應活性約高2-3倍之5株菌；接著，分別抽取質體定序並轉型大腸桿菌BL21(DE3)來大量表現具突變胺基酸的重組蛋白，再將純化後的重組蛋白以免疫分析活性。結果顯示M3b突變株（W84S，P110S和V129L）比野生株抗原活性增加66%，結合力和親和力分別為0.96以及113M-1，而以M3b為檢測抗原可減少約三分之一的抗原使用量。 第二部分敘述以法夫酵母菌和麵包酵母菌利用蔗糖二階段醱酵生產新果寡糖（果糖基以26鍵結至蔗糖之fructofuranosyl殘基）之最佳化條件。第一階段以法夫酵母菌醱酵，最適之蔗糖濃度為450 g/L，其醱酵條件為23ºC、200 rpm、1 vvm及pH 7，使大部分的蔗糖藉由6G-fructofuranosidase（6G-FFase）的催化作用轉化為新果寡糖以及其他糖類，接著提升至pH 8及60ºC處理一小時後，進入第二階段：接種入麵包酵母菌，設定醱酵反應條件為30ºC、300 rpm、1 vvm及pH 7。兩階段醱酵64小時後，可取得約占乾重94.9%之高純度果寡糖糖漿，換算1公克蔗糖可得0.58公克之果寡糖。 總結以新果寡糖用於C型肝炎病情控制的展望。已有文獻指出C型肝炎治療輔以果寡糖以增進益生菌生長來降低肝炎性腦病變之臨床研究。未來可比較新果寡糖與1F-果寡糖在上述研究之成效。
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在肺部疾病中，肋膜腔積液是一種常見的醫療問題，主要肇因於肋膜腔有異常液體的蓄積；肋膜腔積液的體積多寡和成份影響了臨床症狀表現，而不同的潛在病因甚至會影響疾病的預後。發生於肋膜間皮細胞表面上的漿膜炎和白血球細胞的趨化作用被認為與胸腔積液的形成機轉有關。此外，局部組織“腎素血管收縮素系統”似乎也在“損傷/修復反應”機轉中發揮了關鍵作用。目前已知“腎素血管收縮素系統”中的angiotensin converting enzyme (ACE)/angiotensin II (Ang II) /AT1R axis 和 angiotensin converting enzyme II (ACE2)/Ang-(1-7)/Mas axis與組織結構的維護、肺部纖維化疾病以及肺間質纖維化的進展關係密切。另外，基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases; MMPs）和其基質金屬蛋白酶組織抑制因子（tissue inhibitors of MMPs; TIMPs）的表現經常被用來作為細胞外基質（extracellular matrix; ECM）結構重塑的指標。在此研究中，我們探索了ACE/Ang II/AT1R axis、ACE2/Ang- (1-7)/Mas axis、MMPs/TIMPs和肋膜疾病之間的相關性。本項研究還探討了MMP-2和MMP-9在肋膜腔積液患者的基因多態性。 在實驗的第一部分中，我們分析人體肋膜腔積液中ACE/ACE2和MMPs的活性，進而探討ACE/ACE2和MMPs/ TIMPs間的平衡，與肋膜腔積液和肺纖維化的對應關係。 本研究亦針對不同的病患族群，分析其−1059G/A MMP-2、 −735C/T MMP-2和−1562C/T MMP-9的基因多態性。在第二部分中，我們成功建立小鼠肺纖維化模型，用來研究肺纖維化的發病機制，同時也探討ACE/ACE2和MMPs/ TIMPs間的平衡關係。 本研究有幾個結果。首先我們發現：（1）在滲出性肋膜腔積液中，ACE活性顯著升高使得ACE/ACE2的比例明顯升高；（2）在滲出性肋膜腔積液中，MMP-9的活性顯著增加；（3）結核性積液存在較高的ADA、 MMP-9和ACE活性，以及減少ACE2的活性。其次，在漏出性肋膜腔積液、肺炎或腺癌積液中，−1059G/A MMP-2、−735C/T MMP-2和−1562C/T MMP-9的基因多態性並無明顯差別；在homozygous −735CC MMP-2的患者肋膜液中，MMP-2有較高的活性表現。在heterozygous −1562CT MMP-9的患者肋膜液中，MMP-9有較高的活性表現。再者，在動物實驗中，接受bleomycin注射7日後的野生型（WT）小鼠，肺部組織測得較高的ACE和MMP-9活性及TIMP-1濃度，且其組織切片顯示較明顯的白血球細胞浸潤和膠原蛋白堆積。相較於對照組，ACE2基因剔除小鼠於早期（3日）肺部組織中，有較高的MMP-9活性表現和較低的TIMP-1濃度。這些結果顯示，ACE2在bleomycin導致肺纖維化過程中所扮演的重要角色，可能是透過調節MMP-9/TIMP-1的表現來達成。
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人類的P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) 是一種常見於白血球和內皮細胞上約43 kDa醣蛋白，此醣蛋白需透過兩種重要的轉譯後修飾作用，再與細胞黏附分子Selectins產生交互作用。此兩種轉譯後修飾作用，其一為酪胺酸亞硫酸化作用，以酪胺酸亞硫酸基轉移酶 (Tyrosylprotein sulfotransferase, EC 2.8.2.20) 將亞硫酸基轉移至PSGL-1上N端的Tyr-46、Tyr-48、Tyr-51等三個潛在位置；其二為醣化作用，將Sialyl Lewis x tetrasaccharide (sLex)於Thr-57位置上形成O-Linked glycans。根據先前的研究，這類型的亞硫酸化蛋白質不僅參與調節發炎和凝血反應的生理過程，並扮演著調控與腸病毒71型 (EV71) 外殼蛋白VP1間的蛋白交互作用，影響病毒入侵的關鍵指標。然而，目前對於人體中存在亞硫酸化蛋白質的亞硫酸化程度和其穩定性功能仍然有許多疑問，肇因於亞硫酸化蛋白質和非亞硫酸化蛋白質的來源取得和純化分離困難。應用本實驗室已開發的PAPSS-TPST和PST-TPST亞硫酸化酵素連鎖反應平台系統，此論文將從傳統生化方式的角度，以原態凝膠電泳系統分析鑑定亞硫酸化蛋白質GST PSGL-1，並分別由GST PSGL-1 Y51K 和GST PSGL-1 Y51E單一胺基酸正負電荷的差異做為對照組，以辨識亞硫酸化和非亞硫酸化的GST PSGL-1蛋白質。綜合而言，本論文所描述的純化方法、亞硫酸化酵素連鎖反應法和凝膠電泳系統檢測方式提供探究亞硫酸化轉譯後修飾研究的基礎。