中央大學生命科學系學位論文
國立中央大學,正常發行
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抗胰島素激素(Resistin)為一種已知的脂肪細胞所分泌的細胞激素, 它會造成胰島素抗性作用,並扮演著調節能量平衡的角色。之前的文獻中已經找出許多會去調節resistin基因表現的轉錄因子以及其結合位﹐但是其調控機制仍然不清楚。FoxO1 (Forkhead/winged helix box gene,group O-1) 轉錄因子會受到胰島素調控將其磷酸化﹐去決定是否能在細胞核內作用。之前的研究中指出FoxO1與resistin隨著脂肪細胞分化的程度越好,兩者基因在脂肪細胞內皆會有改變﹐而FoxO1參與調控一些胰島素所調控的基因表現。胰島素又會抑制抗胰島素機速基因的表現。因此本論文假設FoxO1轉錄因子會參與脂肪細胞內抗胰島素激素基因表現的調控作用﹐實驗結果證明﹕(1) FoxO1,3,4與resistin 基因之表現確實在脂肪細胞分化的過程中,逐步升高。(2)轉染FoxO1-AAA與human resistin promoter(-819~+24 bp)在HEK 293T細胞株中。發現FoxO1隨著劑量增加而有負調控該啟動子的活性。 (3) 轉染FoxO1-AAA與human resistin promoter(-819~+24 bp)在NIH 3T3細胞株中。發現FoxO1隨著劑量增加而有負調控該啟動子的活性。由以上結果顯示,Foxo1調節human resistin promoter(-819~+24 bp)活性,不會因轉染細胞株不同而有差異性。 (4)FoxO1-AAA與以架構的三種(-3880~-55 bp,-1330~-55 bp,-990~-55 bp)共同轉染到HEK 293T細胞內,發現FoxO1-AAA均負調節三種mouse resistin promoter的活性。(5)野生型FoxO1,突變型FoxO1-AAA,以及FoxO1-H215R,分別與Human resistin promoter(-819~+24 bp)共同轉染到HEK 293,HEK 293T,或3T3細胞株中。皆發現是負調控該promoter活性。所以顯示FoxO1是間接性調控resistin promoter的活性。綜合以上的結果得知,FoxO1是負調節Human resistin promoter的活性。因為FoxO1-AAA與mouse resistin promoter共同轉染到 3T3細胞株中,FoxO1-AAA正調節該promoter 的活性(採自於學妹楊淑雅的實驗數據),所以FoxO1調節mouse resistin promoter的活性會因轉染不同細胞株而有所差異。
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胚胎幹細胞是屬於具有多能性的幹細胞，主要是由囊胚層裡的內細胞層而 來，而且可以分化成三個胚層和大部份的細胞類型，為了要維持幹細胞的多能性 與自我更新需要外在的調控因子如LIF、BMP，和內在的因子如Oct4 和Nanog。 Oct4 又稱Oct3 是屬於POU 的轉錄因子，之前的研究指出Oct4 只表現在幹細胞中。 Nanog 為一 homoebox 的轉錄因子，在胚胎發育的時候Nanog 在內細胞層的多能 性與細胞命運的決定中扮演著重要的腳色，我們在 C2C12 中大量表現 Oct4 和 Nanog 後發現在細胞進行分化過程中，其肌管的數目明顯下降，其中在 C2C12-Oct4 的穩定細胞株中其分化能力比 control 低，而在同時表現 Oct4 和 Nanog 的穩定細胞株中，並沒有觀察到肌管的產生。在 fusion index 的數據中， 在大量表現 Oct4 時和 control 相比下降了 60% 而且在同時表現 Oct4 和 Nanog 時幾乎趨近於零。 在RT-PCR 的資料中我們也觀察到 MRF 基因家族在 大量表現 Oct4 的穩定細胞株中表現量下降，而在同時表現oct4 和Nanog 時表 現量的下降有更為增強的趨勢，在胚胎幹細胞的特異性基因的表現情況中發現在 大量表現 Oct4 和 Nanog 的穩定細胞株中其表現量上升。Pax7 在大量表現Oct4 的穩定細胞株中表現量下降，中胚層的marker CD34 和血液幹細胞的marker Sca1 在C2C12-Oct4-py-Nanog 細胞株中表現量顯著的上昇。在未來的研究中我們希望 找出Oct4 和Nanog 影響C2C12 分化的分子機制。
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FoxO轉錄因子已經被指出在細胞中有多樣的功能，包括葡萄糖的代謝、壓力反應、分化、細胞週期、細胞的死亡與生存。在FoxO家族成員中的foxo6主要表達在正在發育階段的腦部及肌肉組織，但是其在骨骼肌中主要的功能目前還不知道。PGC-1α是一個轉錄作用的協同活化子且也是一個重要的代謝調控者。而PGC-1α也會調控粒線體的生成，所以當在骨格肌大量表達PGC-1α會導致粒腺體含量增加。當我們誘導C2C12-mFoxO6肌原母細胞株去經歷終極分化，其肌管的大小及肌管的數量都遠比C2C12-control肌原母細胞株來得小及少。當我們誘導Sol8-mFoxO6肌原母細胞株分化，也可以觀察到並沒有肌管的形成。然而我們觀察到C2C12-mFoxO6細胞週期主要都在G0/G1期。我們開始去分析adheren junction的表現量，在細胞分化階段中，這些adheren junction的基因表現量在C2C12穩定表現FoxOs的細胞株中並沒有太大的不一樣，但是在Sol8-mFoxO6細胞株中它們表現量幾乎都是被調控下降的，我們進一步發現Sol8-mFoxO6及C2C12-mFoxO6的分化情形可以在處理胰島素之後有所回復且在Sol8-mFoxO6中其MyoD、myogenin及M-cadherin的表現量可以被回復增加。我們也發現在緊靠擠滿的C2C12中大量表現FoxO6可以抑制PGC-1α的表現，因此我們認為也許是FoxO6經由結合到PGC-1α啟動子上面導致其活性被抑制。經由Reporter assay證明FoxO6的確可以抑制PGC-1α啟動子的活性。在未來，我們希望可以明確知道PGC-1α與FoxO6之間調控的路徑及其對於肌肉分化調控的路徑為何。
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本研究旨在探討水稻小分子量熱休克蛋白質基因Oshsp18.0受脯胺酸(Proline)類似物Azetidine-2-carboxylate (AZC)之誘導模式及其相關調控機制。生物藉由誘導熱休克基因來抵抗外界環境溫度的改變。除溫度改變外，環境中存在之重金屬離子、化學物質或胺基酸類似物，甚至僅酸鹼度的改變皆可誘導熱休克基因之表現。熱休克基因的表現導致細胞內熱休克蛋白質大量累積，有助於增加細胞對嚴苛環境之耐受性，因此植物體於逆境時常累積大量小分子量熱休克蛋白質。將水稻白化幼苗處理致死高溫(48℃)或AZC後可見嚴重離子滲漏之現象。離子滲漏現象可因預先處理非致死性高溫(41℃)而緩和。水稻染色體中存在九個第一族小分子量熱休克蛋白質基因成員。我們針對Oshsp18.0進行詳細研究；發現此基因受高溫、銅、鎘、砷、AZC、酸鹼變化誘導。AZC會取代Proline之位置結合至寡胜肽並使寡胜肽之正常褶疊受到抑制。細胞誘導unfolded protein response (UPR) 以消除AZC引起之不正常蛋白質累積。將水稻白化苗預先處理蛋白質生合成抑制劑(cycloheximide)後，Oshsp18.0對AZC有反應延遲之現象；相對地，Oshsp18.0於高溫逆境並未有反應延遲現象。基因之表現受到轉錄因子及轉錄元素之間交互作用調控；且已有研究顯示，Oshsp18.0及Oshsp17.3二者重疊之啟動子區域存在一段包含九個核苷酸之序列(AZRE)與AZC具有專一性之關聯。綜合以上結果，推論存在特定轉錄因子會與AZRE進行專一性反應。 為獲得此轉錄因子之序列，我們利用yeast one-hybrid之技術釣取此轉錄因子之基因。由篩選所得之基因中，確有參與在UPR相關之基因(包括促進胜肽褶疊、運送、降解及終止蛋白質的合成)。我們選取一具高度重覆性之基因－10-kDa chaperonin－進行gel retardation實驗。結果顯示，此蛋白質並未能在in vitro情況下與AZRE進行鍵結；因此有必要繼續由所篩選所得之基因中挑選其他候選者進行分析。
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LAMR1是一個295胺基酸的非粘著蛋白受器 (non-integrin receptor)，且對層粘連蛋白(laminin)有很高的親合力。此蛋白質主要被發現與癌細胞的浸潤與轉移有很大的關聯。為了研究LAMR1對癌細胞生長的影響並了解參與的LAMR1特殊胺基酸區域，我以人類乳癌細胞株-MCF7為平台，建構了數種穩定型細胞株，包含全長、1-200 a.a.、1-150 a.a.、1-100 a.a.和1-55 a.a.長的LAMR1轉染的細胞株。另外為了利於偵測，也同時建構了一組在不同片段LAMR1 之C端接有Flag序列的轉染細胞株。結果發現，無論是在有Flag或是沒有Flag的組別，全長和1-200 a.a.長的LAMR1片段轉染細胞株在八天的培養期間中，其細胞生長明顯快於控制組細胞。而在其他不同片段LAMR1轉染的細胞株，其生長情形沒有明顯快於控制組細胞。根據以上的結果，我們推測LAMR1胺基酸151-200區域在MCF7生長中扮演重要的角色。另外，因為LAMR1被認為是綠茶唲茶素-表沒食子唲茶素沒食子酸酯 ((-) - epigallocatechin-3-gallate; EGCG）的受器，並且可抑制肺癌細胞的生長。因此，我們藉由不同片段LAMR1轉染的細胞株，想要瞭解LAMR1在EGCG抑制乳癌細胞株MCF7生長中扮演的角色。首先，當我們先以LAMR1抗體處理MCF7時，可防止EGCG對MCF7細胞造成的細胞數目降低。第二、我們發現到當MCF7轉染全長LAMR1後，此轉染細胞對EGCG所抑制的細胞生長與控制組細胞相比有較敏感的現象。因此我們得知全長LAMR1對於EGCG抑制MCF7生長中扮演重要的角色，對此未來可以再利用LAMR1的訊息傳遞蛋白的表現，來幫助我們更加釐清不同片段LAMR1的作用。
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M-和N-cadherin 都是屬於鈣離子依賴型細胞與細胞間黏著分子家族的一員，M-cadherin主要表現在正在發育生成中的骨骼肌中，且在之前已被證實其在肌肉的終極分化階段扮演著非常重要的腳色尤其是在肌纖維母細胞進行融合的時期特別的明顯。藉由N-cadherin的細胞與細胞間的黏著作用同樣的也在骨骼肌的生成過程中有著顯要的地位。 ＭyoD、Myogenine、Myf-5和 MRF4 這四個轉錄因子同時都具有Basic-loop-helix motif 且同屬於肌肉調節因子(Muscle Regulatory Factor , MRF)。 ＭyoD和Myf-5在整個胚胎發育中整個肌肉生成的全部步驟中都是不可缺少的，但是Myogenin 和MRF4則不然，他們是在肌肉生成的後期也就是終極分化時才有顯著的影響。 之前的研究指出在MyoD-/- 肌原性細胞中，並無法行最後的終極分化且M-cadherin的表現量也有很明顯的下降。 我們也知道當細胞缺乏M-cadherin時 N-cadherin 會互補的表現出來而維持細胞正常的功能。 在我們的研究中我們要了解究竟這些肌肉生成調節因子是如何去調控M-和N-cadherin promoter的表現。 首先我製備了M-cadherin promoter質體並且發現MyoD會藉由結合到M-cadherin promoter上而去活化M-cadherin的表現。 接下來我們突變了M-cadherin core promoter上面的 E-box更正確的定義出MyoD及Myogenin 的結合位置。同時我們也觀察及比較MRFs對於N-cadherin的調控是否有不同於M-cadherin調控的部份，發現 MRFs 以及 MEF-2C 對於N-和M-cadherin 活性的調控並不相同，所以之後我們要找出為什麼會不同以及這種不同在生理上代表了什麼意義，未來我們會用ChIP assay (chromatin-immunoprecipitation ) 分析MRF調控M-cadherin和N-cadherin 的生理意義。
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先前研究已知在Saccharomyces cerevisiae中一個VAS1基因(ScVAS1)可以藉由不同的轉錄以及轉譯起始點做出兩種valyl-tRNA synthetase (ValRS)的異構型蛋白質，這兩種異構型蛋白質分別具有粒線體以及細胞質功能。我們發現在C. albicans及Y. lipolytica中唯一的VAS1基因(CaVAS1及YlVAS1)也是由類似的機制做出兩種異構型的蛋白質，這顯示在酵母菌中這種由一個基因做出兩種異構形的ValRS是普遍存在的。此外也發現在酵母菌S. pombe的細胞核染色體中具有SpVAS1以及SpVAS2兩個不同的基因，其中SpValRS2多了一段細菌ValRS沒有的附加區段，且能夠互補ScVAS1剔除菌株之細胞質功能。雖然SpValRS1缺乏附加區段，但是其在胺基端多了一段粒線體標的訊號(mitochondrial targeting signal)，功能試驗的結果顯示SpValRS1不能互補ScVAS1剔除菌株之粒線體功能。除此之外， SpVAS1及SpVAS2皆為S. pombe生長所必須之基因，因此在S. pombe中 SpValRS1很可能是粒線體的蛋白質，而SpValRS2是細胞質的蛋白質。基於這些發現我們推測SpVAS1及SpVAS2很可能是酵母菌ValRS演化的早期狀態，在演化的過程中一些酵母菌丟棄了其中一個ValRS基因，而另一個則衍生出雙重功能。
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Galectins 是ㄧ類哺乳動物之醣類結合蛋白，可以專一性結合半乳糖。先前研究顯示，純化之重組 galectin-1 (GAL1) 蛋白可以干擾小菜蛾(Plutella xylostella) 正常生長發育；為了進一步探討 GAL1 發展成生物殺蟲劑之潛力，本研究深入研究 GAL1 蛋白殺蟲活性及其毒性作用機制。我們首先利用原二色光譜儀 (Circular Dichrosim) 研究 GAL1 在不同 pH及溫度的穩定性，結果發現 GAL1 在 pH 8~9 時較為穩定，而這相當接近於昆蟲腸道的鹼性環境；實驗結果也顯示 GAL1 在 50 0C下結構相對穩定。幾丁質 (Chitin) 及圍食膜 (Peritrophic membrane) 為目前生物殺蟲劑新標的，本實驗結果也證實 GAL1 可和幾丁質以及圍食膜結合。為了瞭解 GAL1 的應用潛力，本實驗成功篩選了 GAL1 的阿拉伯芥轉殖株 (包括全株表現 GAL1-Arabidopsis 及維管束專一性表現 GAL1-Arabidopsis-vas 轉殖株)，於全株表現的轉殖株中，GAL1 表現量約占 0.5 % ~ 1 %；餵食試驗發現 GAL1-Arabidopsis 轉殖株對小菜蛾有明顯的殺蟲活性，包括存活率、平均體重及攝食量都有隨著時間而下降。而組織化學及免疫染色切片都顯示，小菜蛾的腸道都觀察到 GAL1 蛋白的存在 ; 而超微結構顯示，餵食 GAL1-Arabidopsis 轉殖株之小菜蛾腸道表皮細胞和微絨毛都呈現不正常的形態。掃描式電子顯微鏡結果顯示餵食 GAL1 的小菜蛾，其圍食膜都呈現被破壞的現象。此一實驗顯示 GAL1 對小菜蛾之毒性機制可能與幾丁質產生結合作用，而影響昆蟲圍食膜的結構，進而影響其正常發育；由本實驗結果顯示，GAL1 蛋白可以抑制小菜蛾幼蟲正常發育，並具有發展成為生物性殺蟲劑之潛力。
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在酵母菌中有兩套不同的細胞核基因，分別控制細胞質及粒腺體 aminoacyl-tRNA synthetase（aaRS）的合成。這兩套細胞核基因在轉譯完成後，其中一個 aaRS 會留在細胞中進行細胞質蛋白質合成，而另外一個帶有粒腺體標的訊號的 aaRS 則會被送到粒腺體中去作用。然而Saccharomyces cerevisiae HisRS（ScHisRS）只用一個HTS1基因轉譯出兩種異構型酵素，分別在粒腺體與細胞質中進行胺醯化反應。HTS1基因上含有兩個in-frame的ATG，分別為ATG1及ATG21。根據前人實驗的結果發現HTS1基因，會轉錄出兩種mRNA，較長的mRNA包含了AUG1及AUG21，而較短的mRNA只有AUG21。在本實驗中我們選殖了Schizosaccharomyces pombe、Candida albicans和Aspergillus fumigatus的HTS1基因，利用互補性實驗鑑定這些基因的轉譯起始密碼，結果發現它們也有兩個in-frame的AUG，分別做出粒腺體與細胞質酵素。此外當我們比較ScHisRS及大腸桿菌的HisRS序列後，其中ScHisRS較大腸桿菌的N端多了一段34個胺基酸的附加區段，此附加區段並不能活化大腸桿菌GlnRS，因此推測ScHisRS附加區段不能增加E. coli GlnRS對酵母菌tRNAHis結合的親和力。此外，刪除了ScHisRS附加區段對於其細胞質和粒腺體的活性是沒有影響的，所以我們推測在in vivo的情況下HisRS的附加區段對於HisRS的催化活性並非必需的。
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Aminoacyl-tRNA (簡稱aa-tRNA) 的合成，對於蛋白質的生合成是非常重要的步驟，通常是藉由tRNA合成酶將胺基酸接到相對應的tRNA上。不過在Gln-tRNAGln的合成上卻是一個例外。在之前對於Saccharomyces cerevisiae的研究中指出，細胞質的glutaminyl-tRNA synthetase (簡稱GlnRS )是由GLN4基因所提供的，最近的研究發現細胞質的GlnRS會送到粒腺體中參與Gln-tRNAGln的合成。在本篇論文中我們利用細胞質的valyl-tRNA synthetase作為回報基因進一步找出其粒腺體標的訊號的範圍為包含第524 ~ 564號胺基酸，這段序列接近ATP的結合位 (KMSKS保留區域)，這是少數的例子，其粒腺體標的訊號位於在內部序列當中同時也與主要的催化區重疊，但是對於細胞質的GlnRS是怎樣利用一段非傳統的N端粒腺體標的訊號去作用，其機制還不清楚。在Schizosaccharomyces pombe中並沒有發現有粒腺體標的訊號存在，所以我們認為這樣的標的訊號並不是所有酵母菌都擁有的。藉由功能性互補實驗、回報基因測試，發現GlnRS對於粒腺體功能的維持並不是必要的，因此在粒腺體中可能同時存在兩條途徑去合成Gln-tRNAGln。