中央大學生命科學系學位論文
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烷基苯酚聚氧乙基醇 (Alkylphenol polyethoxylate, APEOn) 為非離子界面活性劑，並廣泛用於工業用途。一般家庭、河川底泥與都市廢水系統中皆發現此類化合物之累積。其代謝產物，如壬基苯酚 (Nonylphenol) 或辛基苯酚 (Octylphenol) ，對生物有慢性毒性及潛在的內分泌干擾性。Pseudomonas nitroreducens TX1 為從灌溉渠道底泥中分離出的細菌，能以高濃度之 APEOn 為唯一碳源生長。 P.nitroreducens TX1 的基因體序列草圖已於2014年1月發表，為 APEOn 的降解基因定位與分析提供基本資訊。本研究使用轉位子突變法 (Transposon mutagenesis) 針對辛基苯酚聚氧乙基醇 (Octylphenol polyethoxylates, Triton X-100) 分解菌株Pseudomonas nitroreducens TX1 進行突變，本研究目的在於使用此法篩選無法正常生長於 Triton X-100 培養基的突變菌株。P. nitroreducens TX1使用三親配對法 (Triparental mating) 進行隨機突變後，以生長測試篩選無法正常生長於 Triton X-100的突變菌株。基因分析方面，使用限制酶剪切染色體、DNA 連接酶處理、轉殖試驗、質體萃取、定序與序列比對等方法，進行突變基因定位及功能預測，探討各類突變基因對 P. nitroreducens TX1 分解或抵抗 Triton X-100 的影響。目前自約30000株突變菌株中篩選出145株以 Triton X-100 培養生長緩慢或無法生長的突變菌株。其中130株突變菌株已完成突變基因鑑定。已發現的突變基因依功能可分為六大類，分別為代謝酵素 (15個基因)、膜蛋白 (7個基因)、細胞膜/壁結構組成 (環境壓力反應) (11個基因) 、趨化性 (Chemotaxis) (4個基因) 、非轉錄區域序列 (non-coding sequences) (4個轉位子插入點) 以及未知功能序列 (12個基因)。另外，野生型菌株與部分代謝基因突變菌株已進行 Triton X-100 之代謝產物萃取，並以 HPLC 分析產物。雖然目前透過HPLC之結果尚未找出關鍵的降解基因，但本研究透過轉位子突變篩選的多個基因資訊，可供後續進一步系統性地探討細菌降解難以利用之碳源之代謝途徑或抵抗環境壓力之機制。
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Aminoacyl-tRNA synthetases (aaRSs)是轉譯過程必要的酵素。在真核生物細胞質phenylalanyl-tRNA synthetase (PheRS) 的結構為異型四聚體 (heterotetramer)，由兩個α subunit及兩個β subunit組成。α subunit負責胺醯化作用，催化Phe-tRNAPhe的形成，反β subunit負責編輯作用，將misactivated aa-tRNAPhe水解成胺基酸及tRNAPhe。真核生物粒線體PheRS的結構為α一元體 (monomer)。過去的研究顯示，真核生物粒線體PheRS缺少編輯作用的功能。在病人研究報告顯示，致死性胎兒腦病變與粒線體的氧化磷酸化之缺陷有關，且與人類粒線體PheRS突變有關。然而，這些突變引發致死性胎兒腦病變的機制仍不清楚。本結果顯示，人類粒線體PheRS (HsPheRSm) 突變P136H及P361L可減少胺醯化的活性，但是突變A170G則否。此外，先前的研究顯示，常用於治療帕金森氏症 (Parkinson's disease) 之藥物dopa，會經過錯誤性胺醯化作用而產生dopa-tRNAPhe，導致接受藥物治療的病人體內提高了含有dopa的蛋白質含量。為了測試HsPheRSm突變對於錯誤的胺基酸之辨認，本研究使用phenylalanine類似物meta-tyrosine以及meta-fluoro-phenylalanine來當作受質。在體內實驗結果顯示，含有HsPheRSm突變的細胞生長在含有錯誤的胺基酸之培養基中，並沒有發現到生長上的差異。後續研究將繼續探討HsPheRSm突變與錯誤性胺醯化作用的關聯性。
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酮醇酸還原異構酶可以在植物、真菌和細菌體內找到，而動物體內則沒有此酵素存在。酮醇酸還原異構酶可以應用在產生支鏈形胺基酸、生質能源以及除草劑。酮醇酸還原異構酶是支鏈形胺基酸生合成反應第二個反應的酵素，可以將乙酰乳酸轉變成2,3-二羥基異戊酸。此轉變過程包含了兩個反應，先依靠鎂離子將烷基轉移，之後在消耗菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)還原兩個酮基。我們發現硫化屬古生菌(Sulfolobus solfataricus)中具有三個酮醇酸還原異構酶，分別是酮醇酸還原異構酶-1、酮醇酸還原異構酶-2和酮醇酸還原異構酶-3。這三個酮醇酸還原異構酶的基因序列之間並不完全相同，但是具有相同屬於酮醇酸還原異構酶的保守基因，且尚未了解其在生物體內分別的作用。在我的研究中，以大腸桿菌BL21(DE3)來大量表現酮醇酸還原異構酶-3，並利用快速蛋白質液相層析系統純化此蛋白質，我們發現酮醇酸還原異構酶-3在溶液中是以十二聚體的形式存在，並成功得到此十二聚體蛋白質的晶體，但晶體繞射訊號不佳。因此我們從電顯影像中，利用單分子重建法得到此十二聚體的三維平均結構，並用模擬的原子結構模型代入三維平均結構，嘗試以此方法來預測其四級結構組成，我們發現以單分子三維重構法重建出的酮醇酸還原異構酶-3結構與同一類的酮醇酸還原異構酶非常相似，在未來我們希望利用這個模擬的原子結構來探究其功能。
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Aminoacyl-tRNA synthetases(簡稱aaRSs)其催化生成aminoacyl-tRNAs，提供蛋白質生合成的原料。它們是一群不可或缺且古老的酵素家族，存在於自然界所有的生物體內，正因如此，我們便可利用它們做演化研究的依據。之前的研究指出，酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)的細胞核內有編碼兩種不同的GlyRS基因，分別為GRS1基因(解碼glycyl-tRNA synthetase1，簡稱GlyRS1)和GRS2基因(解碼glycyl-tRNA synthetase2，簡稱GlyRS2)。其中蛋白質GlyRS1，即具有細胞質和粒線體的功能，且與GlyRS2做蛋白質序列比較發現明顯地多了一段嵌入肽鏈(insertion peptide) ，此外，兩種蛋白質在結構和序列上並無明顯差異；而GRS2基因平常於酵母菌體內不表現，類似「假基因(Pseudogene)」，其看似演化留下的痕跡(在高等真核生物並無此基因，且所有已知酵母菌菌株中，只有S. cerevisiae和V. polyspora具有GRS2基因)，但我們發現若以生物技術所獲得其表現的蛋白質GlyRS2，竟然具有催化活性，因此其所扮演的角色及生理意義，遂成為我們研究的終極目的。首先，我們發現GRS2基因在一些極端條件下(高溫、存在酒精、氧化壓力等)，會被誘導使表現量上升，且由實驗結果可知其蛋白質GlyRS2在高溫條件具有較佳的活性及穩定性；接著，藉由從各種不同面向的生物體內和體外實驗結果證明「嵌入肽鏈」對GlyRS1重要性，並與GlyRS2做比較，再更進一步討論GlyRS1和GlyRS2之間演化上的關係；最後，我們由體外實驗結果發現GlyRS2於酸性和存在酒精條件下，催化活性並無明顯變化，反而GlyRS1催化活性大受影響，此結果間接解釋了GlyRS2真正的生理功能，以及為何它在演化這條漫漫長路上罕見地被保留至今，其可能與釀酒酵母菌S. cerevisiae的發酵作用有關。
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流行病學研究指出，當生物體長期暴露在4-胺基聯苯 (4-aminobiphenyl，4-ABP) 的環境下，會造成肝臟細胞的DNA damage與DNA adducts，甚至會誘導膀胱癌的形成。4-ABP進入到人體後，會藉由肝臟細胞的phase I與phase II的氧化還原進行代謝，但過程中會產生自由基，進一步地導致DNA 雙股斷裂。本篇研究主要深入探討，4-ABP所造成的DNA損傷，其細胞內的自體修復機制為什麼不能立即做修補，是不是還有其他因素來調控修復機制? 首先利用comet assay來觀察DNA damage程度，處理4-ABP (0-300M)後，發現4-ABP確實會造成HepG2 cell的DNA損傷。PCR array與miRNAs microarray結果亦顯示，有16個關於DNA repair相關的基因表現下降，27個miRNAs 表現差異高達三倍以上，其中miR-630與miR-513a-5p為最顯著的表現。因此想深入探討，其DNA repair相關基因的失調，是否因為miRNAs所調控。研究結果顯示，miR-630會target在RAD18與EXO1的3’UTR上、miR-513a-5p則會target在XRCC2與FANCG之3’UTR。利用質體轉染技術，讓細胞內的miR-630和miR-513a-5p大量表現或抑制，皆會影響RAD18、XRCC2與FANCG的蛋白質表現。有文獻指出，4-ABP最主要會造成HepG2 cell的氧化性基因損傷並導致DNA double strands break，因此以miR-513a-5p與XRCC2為本研究主軸。 4-ABP (75M) 與自由基抑制劑NAC結合處理，發現4-ABP誘導ROS的產生，會使miR-513a-5p大量表現，並進一步地導致XRCC2蛋白表現失調。將XRCC2 蛋白大量表現，其DNA damage的程度也有顯著性的被修復。本研究證明了4-ABP、oxidative stress、miR-513a-5p、XRCC2與DNA damage之間的互相調控機制，並釐清4-ABP所造成的DNA damage，其DNA repair system為什麼不能立即修復。最後，本研究提供了一個4-ABP所造成肝臟細胞的氧化基因損傷之預防檢測與治療的方向。
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核糖核酸解旋酶是一種機動蛋白，以三磷酸腺苷水解來產生能量將雙股核糖核酸解開的酵素。DEAD-box核糖核酸解旋酶依照其N端和C端所延伸的氨基酸具有和蛋白質結合的功能，藉著與蛋白質結合的特性，決定其受質特異性、在細胞中的位置和參與生理的功能，因此在基礎細胞中的各個過程裡包括核醣體生成、信使核糖核酸接合、核糖核酸運輸、核糖核酸轉譯和核糖核酸降解等等中扮演著相當重要的角色。目前的研究發現水稻中有62個不同的DEAD-box 核糖核酸解旋酶。此論文是研究水稻中DEAD-box 核糖核酸解旋酶，OsRH2。OsRH2為真核起始因子4AIII蛋白質，與OsRH34同為真核起始因子4AIII蛋白質且與OsRH2為高相似度蛋白。OsRH2是持續表現的一個基因且先前的研究中發現受到冷逆境所誘導。我們利用核糖核酸干擾的方式來產生轉植株並做其生理分析，經由分析我們現已獲得三個獨立植株分別命名為OsRH2Ri -2b, -4及-14b。我們從這些植株的性狀中觀察到植株矮化、較短的穗長和節間、繁殖期延後、胚胎缺失、不正常的花粉和低捻實率。這些性狀類似於吉貝素相關的賀爾蒙發育缺失，在吉貝素生合成或吉貝素感應相關蛋白質的突變株上可以觀察到。此外，OsRH2核糖核酸干擾轉植株顯示在吉貝素20氧化酶2酵素表現中發現未切除乾淨的內含子片段的信使核糖核酸有所累積。從目前的研究中我們可以發現OsRH2參與在信使核糖核酸的接合外同時影響水稻的生長發育。
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當組織受傷，受損細胞釋放出多種化學物質，如氫離子、前列腺素E2、生長因子、細胞因子、激肽等。這些發炎介質會透過活化蛋白質激酶A （PKA）或蛋白質激酶Cε （PKCε） 使痛覺相關的傷害感受器敏感，進而導致發炎性疼痛。並由之前的研究結果證實急性轉為慢性發炎性疼痛與PKA和PKCε有關。但目前還不清楚是由哪些基因參與調節。也由於氫離子在過去的實驗中有發現是誘發發炎性疼痛很重要的因素，因此認為酸敏感受體於PKA與PKCε轉換之間扮演著重要的角色。為了解決這個問題，我們使用基因剔除或過度表現酸敏感受體的小鼠進行實驗。結果發現無論ASIC3和TRPV1基因剔除小鼠都會縮短CFA引起的機械性痛覺敏感現象。此外，由TRPV1拮抗劑阻斷TRPV1基因也可縮短了CFA誘發的慢性機械性痛覺敏感現象。並於早期階段G2A的過度表現可以透過Gαi路徑降低由 CFA引起的機械性痛覺敏感現象。
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自體免疫疾病是一個慢性的情況，起始於自體抗原的免疫功能喪失代表異質的雜亂，而去攻擊特定器官或是多種器官系統。類風溼性關節炎是一種慢性、漸進式、全身性的、特徵是關節滑膜結締組織嚴重破壞的發炎疾病。類風溼性關節炎主要涉及組織的發炎，而不是關節退變。雖然發炎會造成類風濕性關節炎病患的疼痛，但這並不是唯一造成疼痛的原因。 有些病患使用抗發炎疾病修飾抗風濕性藥物治療並不能改善疼痛的情況。關節發炎通常伴隨著組織酸化。因此，酸敏感接受器對於類風溼性關節炎可能扮演關鍵角色。使用兩種基因剃除(ASIC3和TRPV1)的小鼠來研究類風溼性關節炎。每周在關節注射一次5µg CFA，連續四周，用以建立模擬類風溼性關節炎小鼠的動物模式。模擬期間測量關節寬度和關節組織病理變化，以監測關節炎的過程。以Von Frey尼龍絲來評估注射CFA後小鼠的疼痛行為反應。在野生型和基因剔除的小鼠關節注射CFA會誘發二級機械性痛覺敏感現象。ASIC3和TRPV1基因剔除的小鼠可以減緩類風溼性關節炎在後期的機械性痛覺敏感現象。
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E-boxes參與MyoD活化M-cadherin的轉錄 肌肉調節因子(MRF)家族已被證實，可以透過辨認促進子(E-box)來調控肌肉細胞命運的決定及肌管的形成。 在肌肉發育的過程中，肌肉調節因子透過辨認啟動子上的促進子來活化肌肉相關基因的轉錄。 過去的研究顯示，MyoD可以透過辨認M-cadherin近端啟動子(-252~+200 bp)上的促進子來活化M-cadherin的轉錄。 在M-cadherin近端啟動子上，已知有五個促進子，單一促進子突變的結果顯示，第四號促進子(E-box 4)為M-cadherin啟動子上最為重要的促進子。 因此，對於促進子間的交互作用是否影響MyoD調控M-cadherin的轉錄，仍有待進一步的調查。 最近的實驗結果顯示，除了第四號促進子，第三號促進子(E-box 3)對於MyoD活化M-cadherin的轉錄也十分的重要。 此外，MyoD活化M-cadherin轉錄的效率，可能與啟動子上促進子的數量有關，一旦同時突變超過三個以上的促進子，MyoD活化M-cadherin轉錄的能力將大幅的下降。 實際上，在正常的生理狀態下，MyoD通常會與E47結合，並以二聚體的形式來作用。 因此，為了模擬生理狀態下MyoD的功能，透過一小段具有伸縮性的胺基酸鏈來連結MyoD與E47，以強迫MyoD與E47形成二聚體，此人為修飾的肌肉調節因子MyoD~E47，除了較自然的肌肉調節因子具有更強力的轉錄活化能力之外，還能有效避免細胞內抑制子與MyoD結合。 儘管MyoD~E47相較於MyoD來說，確實可以顯著提升M-cadherin的轉錄效率。 但是MyoD~E47仍無法克服在M-cadherin啟動子上需要三個以上的促進子來完全活化M-cadherin的轉錄。 總結來說，在M-cadherin啟動子上，促進子與MyoD之間確實存著交互作用，但是詳細的調控機制仍有待進一步釐清。 Stra13調控PGC-1α的轉錄活化能力 粒腺體透過進行有氧呼吸來產生高能的三磷酸腺苷(ATP)，用以提供無數細胞活動與生存所需的能量。 PGC-1α已被報導可以協同細胞核上的受體(nuclear receptors)來共同調控粒線體的增生與功能。 除了調節粒線體的功能與數量外，PGC-1α也被證實參與了抗氧化及代謝方面的調控。 最近我們實驗室有了一個嶄新的發現，PGC-1α可以與basic helix-loop-helix (bHLH)家族的抑制子Bhlhe40或稱為Stra13產生交互作用。 由於PGC-1α的重要性， Stra13是否會影響PGC-1α所調控的細胞功能是一個值得探討的問題。 實驗結果指出，在Stra13 knockdowned的肌纖維母細胞(C2C12)中， PGC-1α下游基因的轉錄發生了改變。 除此之外，提升的PGC-1α轉錄活化能力，同樣也在Stra13 knockdowned的肌纖維母細胞中被證實。 在生理功能的調控上，Stra13 knockdowned的肌纖維母細胞相較於正常細胞，擁有更多的細胞內自由基(ROS)與減少的粒線體模電位。 增加的氧氣消耗與粒線體數量顯示出，在Stra13 knockdowned的肌纖維母細胞中，粒腺體可能處在一個比較為活躍的狀態。 另一方面，減少的基礎及胰島素誘導的葡萄糖運輸與增加的棕梠酸代謝暗示著，在Stra13 knockdowned的肌纖維母細胞中，細胞對營養利用的偏好可能發生了改變。 就結果來說，Stra13的影響範圍十分廣泛，幾乎影響了全部PGC-1α所參與的調控。 但是，關於這些結果是源於減輕Stra13對PGC-1α的抑制所造成，抑或僅僅只是失去內生性的Stra13所造成的影響，至今尚未十分明瞭，仍有待進一步的釐清。
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轉移是癌症患者治療失敗的主要臨床因數。微RNA分子在癌症進展和轉移扮演一個重要的角色。此項研究是深入探討微RNA分子與高侵入性的口腔癌及乳癌細胞之間的關係。我們分別使用了體外和體內的篩選方式建立了高度侵入性的口腔鱗狀細胞癌（OSCC）及乳癌細胞，並且藉由微小RNA微陣列技術分析這些高度轉移細胞株與其低侵入性母代細胞株的轉錄圖譜。我們以基因表現差異兩倍為門檻，並且使用gene ontology軟體分析找出與侵入相關的微RNA分子以及其下游標的基因。研究顯示所篩選出的全部高侵入口腔癌細胞株及乳癌細胞株其miR-491-5p或miR-149分別表現顯著減少。同時研究也顯示當miR-491-5p或miR-149分別大量表達在高侵入性口腔癌或乳癌細胞時會抑制其爬動和侵入能力，在老鼠模式中也發現大量表達這些微RNA分子會抑制癌細胞轉移的能力。藉由3'UTR報告基因分析證實G protein-coupled receptor kinase-interacting protiein 1（GIT1）同時是miR-491-5p及miR-149的目標基因。另一方面在口腔癌細胞中大量表達GIT1可以回復miR-491-5p及miR-149所抑制的爬動、侵入及轉移的能力。若抑制GIT1的表現則會抑制口腔癌細胞的爬動、侵入和肺轉移的能力。這個研究也證實miR-491-5p藉由抑制GIT1的表現進而減少口腔癌細胞的focal adhesion，同時導致paxillin蛋白的降解及減少paxillin、FAK及EGF/EGFR調控ERK1/2的活性，也抑制了MMP2/9的表現量與活性。在乳癌方面，miR-149同樣藉由抑制GIT1的表現進而促使paxillin及α5β1 integrin蛋白分別走向proteasome及lysosome的分解路徑。此外，我們發現miR-491-5p和FOCAD同時位於染色體9p21.3，我們的實驗證明miR-491-5p是一個intronic微RNA分子，其座落在FOCAD的intron 4。實驗證明當FOCAD的表現被抑制時也會導致口腔癌細胞癌轉移及侵入的能力減少。進一步我們也證實FOCAD與miR-491-5p會一同被表現出來，並且藉由抑制GIT1調控路徑來減少口腔癌細胞的爬動、侵入和轉移的能力。因此，我們的結論是miR-491-5p及miR-149可以同時藉由GIT1的調控路徑有效的抑制口腔癌及乳癌細胞的轉移能力，這些發現暗示著本研究探討的調控機制可能成為臨床診斷和治療的標的。