- 學位論文
斑馬魚 DnaJA3a 與 DnaJA3b 基因在胚胎發育時期功能之鑑定
Characterization of zebrafish DnaJA3a and DnaJA3b gene functions during the embryonic developmental stages
摘要
DnaJA3 是屬於 Dna J family 的成員之一，在過去的研究指出，可能扮演腫瘤抑制蛋白 (tumor suppressor) 的角色。在人類基因的研究中，發現有一個 Tid56 的同源蛋白稱為 hTid1 (human tumourous imaginal disc)，是一種 co-chaperone protein。hTid1 主要具有兩種不同剪接型式的 variant，分別為 Long form 及 Short form。利用 hTid1 序列搜尋斑馬魚基因庫，發現斑馬魚有兩個與 hTid1 類似的基因，分別為 DnaJA3a 與 DnaJA3b。本論文主要的研究目的為探討 DnaJA3a 與 DnaJA3b 在斑馬魚發育時期功能之差異性。利用 RT-PCR 與完整胚體雜交技術 (whole-mount in situ hybridization) 分析 DnaJA3a 與 DnaJA3b 在斑馬魚胚胎發育過程中表達的時間和位置，結果顯示，DnaJA3a 在胚胎發育 12∼120 hpf 各個時期都較為明顯，而 DnaJA3b 在受精後 72 小時表現較明顯，其他時期則不明顯；而在成熟個體組織表現分析顯示，DnaJA3a mRNA 會全身性的表現，而 DnaJA3b 則在腦部和肌肉會顯著的表現。另外利用轉殖斑馬魚的技術，分別構築 wild type (wt) 和 DnaJ 區域變異 (mutant) 的 DnaJA3a 與 DnaJA3b 的表現質體，利用顯微注射 (microinjection) 方式，將不同形式的表現質體注射入斑馬魚胚胎，藉此來探討不同形式 DnaJA3a 與 DnaJA3b 基因表現對於斑馬魚胚胎發育的影響。結果顯示，過量表現正常 DnaJA3a 會造成胚胎的突變與死亡，而過量表現正常 DnaJA3b 的部分則不會影響斑馬魚胚胎早期的發育。過量表現 DnaJA3b DnaJ 區域突變的質體，則會造成胚胎體節發育異常，而過量表現 DnaJA3a DnaJ 區域突變的質體，不影響斑馬魚胚胎外觀。本論文將藉由過量表現不同形式的 DnaJA3a 與 DnaJA3b 蛋白來探討這兩種 hTid1 相似的基因，對於斑馬魚胚胎發育和生長的影響。
並列摘要
The Drosophila lethal tumourous imaginal disc gene, Tid56, has been classified as a tumor suppressor gene. Tid1, the human homologue of the Drosophila Tid56 gene, encodes two alternative splicing isoforms (Tid1 long form and short form). Tid1 belongs to DnaJA3 protein is the member of DnaJ family and act as co-chaperones interact with the Hsp70 chaperone by DnaJ domain. The zebrafish homologue of the hTid1 genes were DnaJA3a and DnaJA3b. By whole mount in situ hybridization and RT-PCR, the expression of DnaJA3a mRNA was ubiquitously during the developmental stages and adult tissues, the expression of DnaJA3b mRNA was mainly at 72hpf during the developmental stages and adult brain and muscle. To investigate the effect of DnaJA3a and DnaJA3b proteins during developmental stage, we constructed the plasmids that expressed the (wild type and DnaJ-domain mutant forms) of DnaJA3a and DnaJA3b proteins. Our result showed that overexpression of wild type DnaJA3a and mutant form DnaJ3b in early zebrafish embryo had sever defect in morphogenesis, but not wild type DnaJ3b. In this study, we demonstrates that the zebrafish homologue of the hTid1 genes (DnaJA3a and DnaJA3b) were required for morphogenesis in zebrafish embryo.