臺北醫學大學醫學科學研究所學位論文
臺北醫學大學,正常發行
選擇卷期
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同源箱基因(homeobox genes)能轉譯出同源區蛋白質(homeodomain proteins)在動物發育與組織器官成熟過程中常扮演轉錄調節因子(transcription factor)的角色。同源區乃一具高保留性的60個胺基酸功能區，能夠與目標基因上游啟動子(promoter)結合以達到調控目標基因是否表現的目的。我們利用退化性引子聚合酶鏈鎖反應(degenerated PCR)的方法在小鼠睪丸的cDNA library找到一新的同源箱基因cDNA，利用該基因同源區蛋白質序列與資料庫比對發現，該基因與prospero-like家族(subfamily)基因有高度相似性，認為其可能屬此一家族，因此將其命名為Tpros (testis pros-like homeobox)。我們發現Tpros基因有複雜的選擇性轉錄（Alternative transcripts），包含兩種蛋白質序列之不同的轉錄型態。經由北方點墨法和RT-PCR分析，得知該基因在小鼠睪丸有高度專一性表現，且約在小鼠出生後第25天開始表現，利用原位雜交分析發現Tpros專一表現在細精小管中的精細胞(spermatid)，推測其可能在精子生成過程後期的型態變化階段中扮演重要角色。我們也建構了Tpros的融合蛋白質，用來生產抗體，未來可利用免疫組織染色（immunohistochemistry）來進一步觀察Tpros在睪丸中表現的情形。根據之前分子特性的結果，我們推測Tpros基因可能在精子生成過程中扮演重要角色。為了瞭解Tpros基因在活體器官內的功能，我們建構了基因剔除小鼠載體，將來藉由分析基因剔除小鼠表型來瞭解該基因的功能。
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中文摘要 在過去臨床研究發現，懷孕期間施打嗎啡或海洛英成癮的母親所生下的小孩，他們的學習能力以及社會適應比一般正常的孩子來的差，其神經病裡機轉仍未清楚。之前我們實驗室已經證實，在懷孕期間注射嗎啡的母鼠，所生之幼鼠的發育過程中，其海馬迴裡的N-methyl-D-asparate (NMDA) receptor以及經由kainic acid所誘發之calcium/calmodulin kinase II（CaMKII）的活性，會顯著比對照組之幼鼠低。如果NMDA receptor和CaMKII的活化，對學習與記憶的能力很重要，那麼懷孕期接觸嗎啡所生幼鼠其學習與記憶能力的發展有可能受影響。因此為了證實上述的論點，我們以水迷宮的實驗，來偵測懷孕期間注射嗎啡的母鼠，所生之幼鼠其學習與記憶的能力。並且以西方墨點法來測量海馬迴中，兩個與學習記憶相關的蛋白質活化型態即活化型PKC和CREB的表現量。水迷宮的實驗結果顯示在出生後第30天，嗎啡組和控制組幼鼠在學習與記憶的能力上沒有什麼差異。但在出生後第60天，嗎啡組的能力都比控制組差。而西方墨點法的結果顯示在出生後第60天，嗎啡組的內生性活化型CREB明顯的比控制組低。另一方面，出生後第30天和第60天，嗎啡組和控制組在活化型PKC的表現上沒有差異。此外，在所有的實驗老鼠中，嗎啡組和控制組在經由KA所誘導活化的CREB和PKC的表現量，皆無顯著差異，。本篇研究推測發育中的幼鼠在出生以前即受到嗎啡的影響，會降低其學習與記憶的能力。並推測這個結果是由於海馬迴中NMDA receptor-CaMKII-CREB此一路徑的活化所受到抑制而造成。
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本研究以生物檢定的方式，採用Salmonella TA102〔Histidine mutation :hisG428(pAQ1)〕檢定菌種，利用修飾Ames test方法，測定品質穩定市場較大的市販可果美蕃茄製品：無鹽蕃茄汁、加鹽蕃茄汁、蜂蜜蕃茄汁等，並以蕃茄紅素、β-胡蘿蔔素、維生素C為對照，檢測其抗氧化活性能力所導致之抑制變異作用的成效；比對本研究室於2002年11月28號日本環境變異原學會31屆大會(東京) 所提的初步報告，探討預防癌症的機制。本研究經再現性結果，已評比出該廠牌蕃茄汁製品 (加鹽暨無加鹽) 的Suppression Rate作用最強，可達0.2mM lycopene之作用的97 %。 安姆式沙門氏菌試驗為利用變異性測定方法，了解測試物質是否具有致突變性或是致癌性的一種檢驗法，應用此原理，藉由觀察加入物質是否具有抑制受到致突變劑攻擊之細菌，減少細菌突變之功效，可得知加入的測試樣本，是否具有保護DNA，使其免於受到致突變劑或是自由基攻擊之效。蕃茄紅素對羥自由基清除效應之濃度劑量反應曲線，隨著蕃茄紅素的濃度增加產生回覆突變的菌落數目愈少，表示抗氫氧自由基的能力隨著濃度的增加而增加，證明了蕃茄紅素具有抗氫氧自由基的作用，lycopene濃度為0.2mM，計算出抑制百分比( suppression ratio )為88 % ，抑制 50% 濃度( IC50 )為0.0153 mM。 實驗結果得之，蕃茄及其製品和蕃茄紅素不僅具有抗氧化的作用，還具有抗變異的效果，無鹽蕃茄汁、加鹽蕃茄汁、蜂蜜蕃茄汁具有不錯的清除氫氧自由基之抗變異功效，且隨濃度增加而抑制效果也隨之增加，呈現正相關的劑量反應作用。β-胡蘿蔔素、維生素C也具有不錯的清除氫氧自由基之抗變異功效，且隨濃度增加而抑制效果也隨之增加，呈現正相關的劑量反應作用。
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白血球（leukocytes）於人體防禦機制上扮演重要的角色，也與生理調控、發育及免疫反應有關。在台灣地區，白血球免疫功能的評估方法及參考值（reference values）仍無定論。為提供給臨床及研究單位準確評估國人的免疫功能，本論文使用具有標準化、便利且低成本的流式細胞技術（flow cytometry）平台開發系統性評估周邊血液白血球（peripheral blood leukocytes）免疫功能的方法。 本論文共分析北台灣地區212位自願者的周邊靜脈血液，經剔除白血球數異常及帶有疾病的個案後，共收納141位7到83歲健康受測，檢測其淋巴細胞亞群分布（lymphocyte subpopulations）、細胞吞噬活性（phagocytic activity）、自然殺手細胞毒殺能力（natural killer cell activity）、周邊血液單核細胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC）的細胞凋亡比例（apoptosis percentage）以及細胞週期（cell cycle）分布情形。以淋巴細胞免疫分型法（immunophenotyping）進行淋巴球亞群分布分析，發現總T淋巴球（total T cells）、輔助性T細胞（T helper cells, Th）、抑制性T細胞（T suppressor cells, Ts）、B淋巴球（B cells）及自然殺手細胞（natural killer cells, NK）的相對比例（relative counts）依序為56.0-85.4%、21.0-53.3%、13.7-42.4%、4.6-23.0%及 4.7-31.0%；其絕對計數（absolute counts）分別為660-2263 /mL、358-1151 /mL、213-981 /mL、59-435 /mL及66-714 /mL，而Th/Ts的比值為0.7-2.7。以標示螢光的大腸桿菌K12菌株進行嗜中性白血球（neutrophils）及單核球（monocytes）的吞噬活性分析，結果分別為88.5- 99.8%及64.3- 97.2%。以K562細胞株測試NK細胞活性，在作用細胞與標靶細胞比例為20:1時的毒殺力為2.2-33.9%。使用亞二倍體法（hypodiploidy analysis）分析PBMC的細胞凋亡比例為0.2-6.5%。分析PBMC的細胞週期，G0/G1、S及G2/M期所占的比例依序為93.9-100.0%、0-4.5%及 0-2.0%。各項實驗結果以SPSS軟體進行數值運算，並以單因子變異數分析（one-way ANOVA analysis）、無母數統計分析法（non-parametric statistical analysis）比較年齡及性別對白血球免疫功能所造成的差異，以雙向邏輯式迴歸分析（binary logistic regression test）比較高危險群與健康對照組的差別。 依統計結果分析，女性在Th細胞分布相對值（p = 0.004）、Th/Ts比值（p = 0.021）、嗜中性白血球的吞噬能力（p = 0.032）較男性為高，具有統計學上的意義；隨著年齡增加，NK細胞相對值（p = 0.001）、PBMC細胞週期中的G0/G1期呈現顯著的增加（p = 0.004），而S期則顯著的下降（p = 0.007）；自然殺手細胞的毒殺力、PBMC的細胞凋亡情形則不受性別及年齡的影響。利用本實驗所整合建立的免疫細胞評估方法，以雙向邏輯式迴歸試驗分析21名白血球數異常及已知帶有痼疾的的受測者，探討健康個體與危險群之間的模式分析，發現本實驗方法可有效評估健康人與危險群的差別，做為評估人類周邊血液白血球免疫功能的篩檢工具。此外，將本論文結果與其他已發表的報告相比較，顯示白血球的免疫功能與種族、性別、年齡及環境因素有密切關係。這些結果或許可以作為評估國人白血球免疫功能的參考值。
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中文摘要 鎘 (cadmium)為一環境污染物，其半衰期長達10-30年，主要經由香菸、食物及空氣污染進入人體，可導致肺臟、腎臟、肌肉、血管與神經退化性疾病。鎘引起細胞凋亡 (apoptosis)之訊息傳遞路徑尚未完全明瞭，本論文以人類正常肺纖維母細胞MRC-5為細胞模式，探討鎘傷害細胞的機制。以AnnexinV/PI雙染色，檢測鎘濃度(25-150 mM)與細胞死亡之關連性，顯示100 ?M鎘可誘導40%細胞凋亡及20%壞死，其細胞凋亡比例達高原期 (plateau)，並隨鎘濃度增加而減少，但細胞壞死比例略增，因此選用鎘100 mM，進行後續實驗。廣泛性caspase抑制劑 (Z-VAD.fmk)無法防止細胞走向凋亡，DNA電泳顯示無DNA片段化現象，證實不同鎘濃度所引起的MRC-5細胞凋亡皆為caspase-independent pathway。本實驗室先前的研究結果指出，鎘可藉由產生活性氧分子 (reactive oxygen species)導致細胞凋亡，且粒線體膜電位有去極化 (depolarization)並釋出AIF (apoptosis-inducing factor)的現象。據此，本論文續以共軛焦顯微鏡 (confocal microscope)觀察粒線體內其他凋亡因子的變化，Bax於鎘加入後四小時，由細胞質向粒線體移動，且粒線體膜電位下降，cytochrome c則稍後被釋放出粒線體；鎘處理細胞八小時，AIF (apoptosis-inducing factor)釋出粒線體並集中於細胞核，此為caspase-independent細胞凋亡之重要指標，同時顯示，粒線體為鎘細胞毒性之早期反應胞器。cytochrome c的釋出應可活化caspase 3，並執行細胞凋亡，但直接檢測caspase 3之活性，並未發現其活化，值得再深入探討。鎘經由多種鈣離子通道進入細胞，影響胞內鈣離子含量與訊息傳遞。以Fluo-3 AM染劑觀察細胞內鈣離子的變化，發現鈣離子的濃度在鎘作用後一小時及三小時有五倍的上升。若以細胞內鈣離子螯合劑 (BAPTA-AM)處理細胞，幾乎可完全抑制細胞凋亡。以calpain inhibitor I (ALLN)進行前處理，約可增加50%的細胞存活，但calpain inhibitor II （ALLM），則無保護細胞功能，顯示阻斷鈣離子釋放及其下游?-calpain活性可抑制細胞凋亡。以NAC前處理細胞，觀察到一及三小時的鈣離子濃度被有效抑制，顯示ROS為鎘誘導鈣離子增加之主因。綜合上述，本論文說明了，粒線體內的凋亡因子及鈣離子對於鎘所造成的caspase-independent細胞凋亡扮演重要角色。
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自從HOM-Mel-40抗原在皮膚黑色素瘤的病患中，以血清學方法被鑑定為腫瘤相關抗原之後，更加肯定在癌症病人體內具有對抗自體腫瘤的免疫力。因此，利用自體細胞毒素T淋巴細胞( autologous cytotoxic T lymphocytes )或其血清抗體去選殖腫瘤抗原，成為一種可行的手段。在本篇實驗中，所使用的抗體是從肺癌病患CA926的胸水所純化而來。此抗體辨識自體抗原p48具有專一性，而且是屬於免疫球蛋白G及M類別，而非免疫球蛋白A。西方點墨法分析以CA926抗體做為探針，顯示在非癌肺組織及代表正常的肺表皮細胞株WI38中，CA926抗體能辨識的p48抗原並未被偵測到，因此推測在癌化過程中p48蛋白可能是過量表現於腫瘤細胞中。同時，CA926抗體之標的物，p48抗原也出現於另一株肺腺癌腫瘤細胞株PE089中。經體外培養，其細胞裂解物可大量獲得，並利用DEAE陰離子交換樹脂及硫酸銨鹽沉澱等生化技術，將此p48抗原純化。隨後， p48蛋白再經由12.5 %含SDS之長蛋白膠中分離，硝酸銀染色使蛋白顯現，之後即切下p48蛋白並以質譜儀分析，來鑑定其蛋白。此結果認為p48蛋白為α-enolase。為了進一步確認α-enolase是CA926抗體的目標蛋白( target protein )。本研究中以分子選殖方式產生GST- enolase融合蛋白並表現於JM109大腸桿菌細胞中。再利用西方點墨法以CA926抗體為探針，其結果顯示CA926抗體能辨識GST- enolase融合蛋白與經thrombin蛋白酶切除GST後的enolase蛋白，但未能辨識GST tag蛋白。此證實了α-enolase確實為 CA926抗體之目標蛋白。而它的過量表現可能與癌化過程相關。在未來的實驗中，我們有興趣知道有多少癌症病患血清中含有對α-enolase有辨識能力之抗體，此外，並探討其存在是否與疾病的惡化有所關聯。因此，在本研究後，約100位癌症病患的胸水或腹水將會被篩檢以回答以上問題。
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子宮內膜異位症(endometriosis)是一種常見於生育年齡婦女的疾病，其定義為子宮內膜出現及生長於子宮以外的部位，其最常出現的併發症是痛經與不孕症(infertility)，約有30%的患者有不孕症的問題。造成子宮內膜異位症的病因尚未完全明確，目前許多研究認為當環境適當而且免疫系統無法清除異位內膜組織時，異位子宮內膜組織便能夠生長，造成子宮內膜異位症。本實驗中以濾泡液及腹腔液作為檢體，以蛋白質體學(proteomics)的方法-二維電泳(two-dimensional electrophoresis)，比較子宮內膜異位症與正常病人的濾泡液及腹腔液中蛋白質組成是否有所不同，找出表現量不同的差異性蛋白質以期增加對子宮內膜異位症病理機轉的了解及找出適用的疾病診斷標記。我們嘗試以不同的二維電泳條件包括：檢體前處理、染色方式、等電點電泳條件、IPG strip的選擇，以求出最適合本實驗的狀態，經比較二維電泳膠片之後判斷出穩定出現於每次實驗，及具有差異表現量的蛋白質，且針對這些蛋白質進行了質譜儀分析，鑑定出穩定表現量的蛋白質包括有：serotransferrin、serum albumin、alpha-1 -antitrypsin、actin、apolipoprotein A-1、及transthyretin；在腹腔液中內膜異位組表現量高於對照組2倍的蛋白質有：haptoglobin-2，fibrinogen。以西方墨點法(Western blot)確認腹腔液中serotransferrin、apolipoprotein E、及apolipoprotein A-1的表現量在內膜異位組及對照組相近，無顯著差異。以西方墨點法偵測fibrinogen的表現量並無顯著差異，而腹腔液中haptoglobin的表現量在內膜異位組及對照組雖無顯著差異，但是58.33%內膜異位組的病人表現量高於對照組平均值，顯示在內膜異位組haptoglobin有升高的趨勢。
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癌症是由於基因的缺損而造成不正常的增生而成﹐在臨床上﹐針對癌細胞的化學療法﹐大都是由影響細胞週期的分子調控著手﹐冀望能因此影響DNA完整性﹐進而造成細胞週期停滯，誘發癌細胞的凋亡(apoptosis)。臨床上的化療藥物卻有令人詬病的副作用﹐嚴重影響到病患的生活品質(quality of life)。本研究是針對人類大腸癌細胞colo205﹐經由篩選臨床上已安全地使用於非治療大腸癌的藥物﹐希望能找到藥物在體外誘導大腸癌細胞的凋亡。本研究是由四個部分所組成：DNA裂解及梯度(DNA fragmentation and laddering)、細胞生長曲線(cell growth curve)、細胞週期及凋亡體(apoptotic body)偵測，及西方墨蹟法(Western Blot assay)。有15項藥品被選用於初步的篩選﹐再與培養的colo205細胞作用後﹐以電泳方式觀察有無DNA laddering現象(此為凋亡之特有性表徵)，接著將篩選出的藥品﹐依濃度梯度與培養的colo205細胞作用一至三天﹐並於每天計算細胞總個數以求出細胞生長曲線。再以流式細胞儀(Flow cytometer)分析在細胞週期中﹐各細胞週期佔所有細胞的比率及凋亡體(apoptotic body)發生之比率。電泳的結果顯示﹐僅有經Cyprohepatadine處理過的Colo205細胞﹐產生DNA laddering的現象﹐而且其電泳結果的laddering清晰度隨著藥物劑量的增加而增加。細胞生長曲線的結果亦顯示﹐即使是20mM的Cyprohepatadine﹐也能成功地在體外抑制大腸癌細胞的增生﹐而80mM以上的Cyprohepatadine更能在24小時的時間內就已完全誘殺Colo 205細胞。在流式細胞儀的分析結果中﹐Sub-G1峰的apoptotic body隨著Cyprohepatadine劑量的增加而增加﹐G1峰的比例隨著Cyprohepatadine劑量的增加而增加,這顯示出Colo205被誘導進入停滯於G1細胞週期,形成apoptotic body而進入凋亡。Western blot assay 顯示p53,p27, cytochrome C, caspase, Bad,Bax, 及PARP隨著Cyprohepatadine劑量的增加而增加, 這暗示出Colo205是經由p27抑制cyclin E-cdk2 ,以抑制其促進G1轉向S期,被誘導進入停滯於G1細胞週期; 經由p53路徑,間接或直接促mitochondria釋放出cytochrome c,啟動caspase pathway, 進而形成apoptotic body而進入凋亡。本研究的結果顯示﹐Cyprohepatadine確可在體外誘發大腸癌細胞的凋亡。此結果可做為日後發展化療藥物的參考。
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化學療法是今日控制轉移性腫瘤生長最常使用的方法之一，然而也因此發生了腫瘤細胞產生抗藥性的問題，已經有報導指出抗藥性的產生，往往加速了腫瘤細胞更快的生長導致病情惡化。因此，本篇論文研究利用臨床上普遍使用的抗癌藥物Adriamycin(ADM)，對於人類非小細胞肺腺癌(Non-small Cell Lung Carcinoma, NSCLC)細胞株NCI-H23所產生的抗藥性而引發細胞不受TGF-β的生長抑制調控加以探討。 以NCI-H23細胞株做為本研究計劃的實驗用細胞，經過ADM的處理進行長期的培養，最後得到一株具有抗藥能力(0.1 μM ADM)的細胞株(NCI-H23/ADR)。在生長速率的實驗中，發現NCI-H23母株受到TGF-β1誘導，使得細胞倍數生長時間由36小時遲緩至96小時，但在抗藥株中並不受到調控。利用RNA萃取技術，收集原母細胞株及抗藥性細胞株的total RNA，並以RT-PCR的技術觀察MDR-1及TGF-β相關基因表現情形，也未發現兩株細胞TGF-β訊息傳遞系統的基因表現有所差異。但經由Luciferase assay則發現NCI-H23母株及抗藥株細胞受到TGF-β1時，相較於貂肺上皮細胞株(Mv1Lu cell line)，Smad蛋白並沒有完全的被活化來啟動目標基因，在流式細胞儀分析細胞週期的G1 arrest及細胞凋亡的結果中，NCI-H23細胞亦皆完全不受TGF-β1的影響，兩株細胞皆沒有明顯的細胞週期G1 arrest和細胞凋亡現象。最後以西方點墨法(Western blotting)分析和細胞生長有關的蛋白在TGF-β誘導下的表現，包括MAPK成員，如ERK、p38以及JNK等激酶活性，還有AKT/PKB、Smad2和p53蛋白的表現程度，在NCI-H23母株及抗藥株細胞中的表現並沒有顯著的差異。但在PKC活化的表現上，可以看到NCI-H23母株細胞在TGF-β誘導下，48小時後提高了PKC的活性，相對地，在抗藥株細胞中，一直遲至96小時才觀察到PKC的活化表現。另外，在STAT3的活化表現上，僅僅發生在TGF-β誘導了NCI-H23母株細胞上，而在抗藥株細胞方面則不受到TGF-β所調控，因此，NCI-H23母株細胞生長週期的延遲可能與STAT3在NCI-H23母株細胞中漸增的活化有所關聯。 本篇研究的結果顯示，當NCI-H23細胞獲得抗Adriamycin的抗藥性之後，便失去了受TGF-β所調控的生長抑制，而抗藥性的獲得並不會造成NCI-H23細胞株的TGF-β接受器蛋白表現有所差異。NCI-H23母株細胞受到TGF-β1的生長抑制作用並非由細胞週期的G1 arrest或是造成細胞凋亡所引起，而是延遲了細胞的生長週期。其間TGF-β的傳遞也並非經由Smad蛋白所引導的訊息傳遞系統，而可能透過JAK/STAT路徑的傳導，NCI-H23母株經過TGF-β1處理後，STAT3漸增的活化可能就是導致細胞生長遲滯的原因。
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鉈曾被發現具有神經毒性，我們利用C6 glioma細胞研究鉈中毒之分子機制。MTT assay顯示鉈會抑制細胞生長。流式細胞儀分析顯示在300μM濃度下，鉈會引起C6 glioma細胞之細胞周期停止和凋亡；Bad蛋白（凋亡促進蛋白）隨著鉈濃度上升有增加情形，而抗凋亡蛋白（Bcl-XL及Bcl-2）則明顯減少。投予鉈之C6 glioma細胞，其p21蛋白量有顯著增加。這些結果顯示鉈會誘導p21蛋白增加，造成C6 glioma細胞之細胞周期停止和凋亡，進而抑制其細胞生長。