臺北醫學大學醫學科學研究所學位論文
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血管平滑肌細胞屬於貼附型細胞，在其生長過程中，細胞外基質( Extracellular matrix )扮演重要的角色。細胞生長時，經由integrin receptor(具a、b兩個次單元)接受外在蛋白質如fibronectin的活化，產生局部附著作用( focal adhesion )，與細胞外基質結合，造成平滑肌細胞的延展( cell spreading )。在這一系列作用中，會造成protein kinase C pathway的活化。 本篇論文探討蛇毒蛋白triflavin，一種含有RGD (Arg-Gly-Asp)胜肽序列，主要功能在與血小板GP IIb/IIIa complex結合達到抑制血小板凝集作用的disintegrin；將其投與入平滑肌細胞後，應會干擾fibronectin與平滑肌細胞之附著情形；並與抗凝血製劑ReoPro® ( Abciximab )對平滑肌細胞和fibronectin附著情形的影響做一比較。藉由細胞免疫染色及共軛聚焦顯微鏡技術的應用，觀察此反應中，protein kinace C family是否受到活化及其分佈情形，證明triflavin與一般已知的人工RGD蛋白序列，對於平滑肌細胞上integrin receptor產生相同的抑制效果。 Fibronectin刺激造成平滑肌細胞中protein kinase C產生一短暫升高並轉移到附著作用發生處，事先給予RGD peptides可抑制此情形。若改以triflavin事先投與，其對protein kinase C的表現也有明顯的抑制作用；且抑制功效不亞於ReoPro®造成的抑制成果，甚至更好。證明triflavin可成功結合到平滑肌細胞的 integrin上，達到抑制平滑肌細胞生長。
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前言：近年來，音樂治療在健康照護領域開始被廣泛地運用。在研究者的工作領域中，心理疾病職能復健部門之病人參與靜態治療活動治療時，常會出現許多諸如肢體暴力、大聲喧嘩、離開團體、發呆、傻笑…等不適切行為，國外許多學者即建議可藉由古典樂來做為背景音樂，以音樂介入的方式來觀察老人失智症、精神分裂症..等腦部機制病變病人當下的行為改變，結果發現其諸如肢體暴力、躁動..等不適切行為大為降低。而許多職能治療的期刊也建議可在職能治療活動中配合介入音樂治療，以增加治療效應，其他諸如一些相關護理期刊，也對於在精神科病房使用音樂治療的正面成效多有描述。 目的：本研究的目的即為探討音樂可否降低台灣精神病患者的不適切行為，以實驗設計的方式進行觀察記錄，並選定台北市某醫學中心38位精神部日間留院病房之病人，以莫札特K448來做背景音樂，並用電腦合成音樂的方式來探討當不同音色（方形波、鋸齒形波、三角形波）的背景音樂介入時，那種波形的音樂對降低病人參與靜態職能治療活動時的不適切行為最為有效，以及音樂治療介入的成效跟腦認知功能間的相關性。 結果：結果發現三角形波最能普遍地降低病人的不適切行為，而三種波形介入時，病人不適切行為發生次數的變化，與認知功能呈負相關，意即認知功能越低的病人卻易受音樂介入的影響而使其在臨床上的不適切行為次數發生變化。 討論：若是本研究的數據，日後經重複實驗後也有類似的結果，則治療師則可考量在療程中適時、適當地介入背景音樂，以改善病人參與復健活動的情況，進而提升復健效率。
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Flavonoids廣泛存在於自然界中，屬於多酚類化合物其中一類，文獻指出flavonoids具有抗發炎、癌症預防發生以及抑制腫瘤等功用。本研究的目的在於探討結構相類似之flavonoids於皮膚癌細胞所造成細胞毒性的機制為何。三種惡性程度不同的皮膚癌細胞A431（人類上皮細胞癌）、RPMI 7951（人類惡性黑色素細胞瘤）以及Hs 695T（人類非黑色素細胞之黑色素瘤）處理17種結構相類似之Flavonoids（Flavanone, 2’-OH Flavanone, 4’-OH Flavanone, 6’-OH Flavanone, 7’-OH Flavanone, Naringenin, Narigin, Taxifolin; Flavone, 3-OH Flavone, 5-OH Flavone, 7-OH Flavone, Baicalein, Kaempferol, Quercetin, Morin and Myricetin）後均有不同程度的毒性反應，其中以2’-OH Flavanone及3-OH Flavone對該三種癌細胞最具細胞毒性。Acridine orange染色得知2’-OH Flavanone及3-OH Flavone會誘導癌細胞發生染色質濃染的情形。此外本實驗發現2’-OH Flavanone 會造成sub-G1比例升高、caspase-3及PARP的活化情形，而利用西方點墨法亦檢測出三株皮膚癌細胞的Bcl-2表現量會隨時間增加下降，而在p53、p21、BclxL、Bax、Bad及Mcl-1等則無明顯變化。上述的情況在3-OH Flavone組並無被觀察到同樣的情形。以DCFHDA方式偵測2’-OH Flavanone與3-OH Flavone對細胞的自由基含量是否有影響的結果顯示2’-OH Flavanone會促進自由基產生，而3OH Flavone會降低細胞內自由基的含量。在動物實驗方面，在BALB/c-Hfhllnu mice臀部兩側皮下注射106/ site A431細胞，人工誘發腫瘤生長約至50 mm3後以塗抹方式及直接注射腫瘤的方式分別給予25 mg/ site, 及50 mg/ site 之2’-OH Flavanone。結果顯示直接注射2’-OH Flavanone 之25mg/ site及50 mg/ site明顯抑制癌細胞之生長。結果推論為2’-OH Flavanone可能是經由產生自由基活化caspase-3及PARP最後造成A431、RPMI 7951及Hs 695T 皮膚癌細胞之細胞凋亡。而在動物實驗證實2’-OH Flavanone的確能抑制皮膚癌細胞的生長。
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異位性皮膚炎是一種慢性反覆的發炎性皮膚疾病，病患通常搔癢難耐，並且在特定部位有濕疹樣變化，患者個人或家族常有異位性體質(Atopy)。CC趨化激素是具有促發炎能力的分子，在異位性皮膚炎與過敏的病理機轉扮演重要角色。我們利用ELISA來檢測病人組與對照組血漿中趨化激素的濃度，並使用流式細胞儀來測量週邊血液單核球上趨化激素受體的表現量。實驗結果顯示病人組血漿中的免疫球蛋白E、RANTES、MIP-1與Eotaxin的濃度較對照組高。病人組血漿中的MCP-1較對照組低。趨化激素受器CCR2、CCR3與CCR5在兩組間表現並無差異。此外，RANTES啟動子區域的多型性對於RANTES的分泌量與異位性皮膚炎盛行率的影響已被廣泛討論，之前的研究顯示在德國與匈牙利異位性皮膚炎病童中RNATES啟動子的多型性與疾病有不同的相關性，因此我們利用聚合脢連鎖反應與直接定序法來分析台灣地區異位性皮膚炎患者與對照組的RANTES啟動子區域的多型性。結果顯示，兩者之間的多型性表現並無差異。綜合以上研究，IgE與CC趨化激素中的RANTES、MIP-1、Eotaxin在台灣地區異位性皮膚炎患者體內的表現量確實有上升，而RANTES驅動子在-28與-403位置產生的多型性與異位性皮膚炎並無相關。
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Matrix metalloproteinases簡稱MMPs，為一群結構類似且含鋅(zinc)金屬離子之蛋白酵素。因MMPs的催化作用需金屬離子加以活化，並且能夠催化分解維持組織結構之細胞外基質蛋白，包括基質與結締纖維組織，故稱之為基質金屬蛋白酵素，而其對於組織之結構重組、修補與破壞都扮演相當重要之角色。 在大規模中藥材萃取物及化學合成等藥物之成分篩選實驗中，我們發現在histone deacetylase inhibitor II (HDI II) 及 咖啡酸衍生物中的VC-1，皆具有明顯抑制MMPs活化之作用。在電泳酵素分析法中觀察到HDI II及VC-1確實有意義地依濃度效應抑制對於TNF-?或IL-1?誘發人類單核球細胞之MMP-9活性，此外以細胞存活率測定(MTT assay)發現HDI II及VC-1的抑制作用並非源自細胞之損害。 從西方點墨法(Western blot)實驗中，發現在不同刺激下(如TNF-?或IL-1?) 細胞MMP-9 protein的表現量會隨著HDI II及VC-1濃度的增加而降低，故可證實此兩種藥物作用在MMP-9蛋白質表現層面。並進一步以RT-PCR的實驗加以分析，發現HDI II及VC-1會抑制MMP-9 mRNA的表現，更深入瞭解細胞轉錄(transcription)之影響程度。同時我們也更進一步探討HDI II及VC-1在訊息傳遞中作用機轉的方式，從實驗結果得知HDI II及VC-1會明顯抑制由TNF-?或IL-1?刺激所導致Inhibitor-?B-??(I?B-?)的降解作用，使Nuclear factor-?B (NF-?B)無法進入細胞核中與特定MMP-9相關的DNA序列接合，同樣的我們萃取核內蛋白發現HDI II及VC-1會抑制NF-?B的表現。在Mitogen-activated protein kinases (MAPKs)方面，從目前實驗結果得知HDI II及VC-1對於c-Jun-NH2-terminal kinase (JNK)和extracellular signal-regulated kinases (ERKs)並無直接的影響。另外，從流式細胞儀的結果發現HDI II及VC-1並不會抑制THP-1細胞表面CD11b的表現。 綜合目前實驗的結果，發現HDI II及VC-1的確具有抑制MMP-9表現之活性，而在TNF-?或IL-1?刺激方面其作用機轉可能主要藉由影響NF-?B的訊號傳遞過程。未來也將會進行更多相關之實驗及活體實驗以瞭解其是否具有抗發炎療效之功能。
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綜合目前的實驗結果發現，天然物 cinnamophilin 與組織蛋白去乙醯化抑制劑 (Histone deacetylase inhibitor II，HDI II)，確實具有抑制 MMP-9 表現之活性，而cinnamophilin 在 LPS 所刺激方面其作由二十幾種酵素所組成的基質金屬蛋白酵素(Matrix Metalloporteinases，MMPs) 能夠催化分解各種維持組織結構的細胞外基質蛋白(extracellular matrix ECM)，其中包括了基質(ground tissue)、與結締組織 (connective fibers)，因此MMP在對於組織的重組(remodeling)、修補 (repairing) 與破壞 (destroy) 上便扮演了相當重要的角色。MMPs 與 ECM 的結締組織分佈息息相關。 MMPs在一般生理與病理上皆扮演著重要的角色，其中包括了基質的破壞與修補、癌細胞的入侵、類風濕關節炎中不正常的軟骨組織破壞或粥狀動脈血管斑塊組織的剝離等。一般而言，許多病理與生理因子都會影響與調控MMPs的釋放與產生。具有趨化作用的化學激素chemokines如monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) 和發炎性細胞激素，如tumor necorsis factor-a (TNF-a)、interleukin 1b (IL-1b)、以及細菌類毒素如lipopolysaccharide (LPS)，均會影響與刺激發炎性細胞表現MMPs基因與其蛋白質的生成。MMPs同時也會受到相關生理性之內生性之抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases， TIMPs) 所調節、目前所知有四種，如TIMP-1會抑制MMP-9的表現。 在大規模中藥萃取物及化學合成藥物成分篩選實驗後，我們發現，一種由天然植物 Cinnamomum philippinense 中所粹取出來的天然物成分cinnamophilin (MA-1) 與一種能誘發細胞生長停滯的組織蛋白去乙醯化抑制劑 Histone deacetylase inhibitor II (HDI II)，皆具有明顯抑制 MMPs 活化之作用。 在先導試驗中我們以人類單核球細胞 (THP-1 cells) 為實驗細胞，分別以不同濃度的 LPS 或 MCP-1 處24 小時候，以電泳酵素分析法(gelain zymography) 評估可發現到人類單核球細胞能誘發大量 MMPs 的活性，其中更以 MMP-9為甚。尤其當 LPS 與 MCP-1刺激濃度分別在10 ng/ml 與240 ng/ml，細胞數為1×106時，此分解 gelatin 的效果最為明顯適當。隨後的實驗便以此為試驗條件，的確在電泳酵素分析法下觀察到cinnamophilin (1-50 mM) 與 HDI II (0.01-5 mM) 皆有意義地依濃度效應抑制 LPS 或 MCP-1 誘發人類單核球細胞之 MMP-9 活性。另外以細胞存活率測定 (MTT assay) 發現 cinnamophilin 與 HDI II 的抑制作用並非源自細胞之損壞或死亡。 以西方點墨法 (Western blot) 的實驗發現在 LPS 的刺激下，MMP-9 的酵素蛋白表現量隨 cinnamophilin 與 HDI II 的濃度增加而降低，故此證明天然物成分與組織蛋白去乙醯化抑制劑是作用在 MMP-9 蛋白質表現的層面。並進一步的以 RT-PCR 的實驗加以分析，發現 cinnamophilin 與 HDI II 均會抑制 MMP-9 mRNA 的表現。由此我們更深入瞭解細胞轉錄 (transcription) 之影響程度。接下來我們探討cinnamophilin 與 HDI II 在訊息傳遞中作用機轉的途徑。由實驗結果發現，cinnamophilin會明顯抑制由LPS所刺激導致的 Inhibitor- kB-a (IkB-a) 的降解作用，使 nuclear factor-kB (NF- kB) 無法進入細胞核中與特定 MMP-9 相關 DNA 序列接合。然而，HDI II 對於 IkB-a 的降解作用卻不明顯。在 mitogen-actived protein kinase (MAPKs) 方面，由我們目前的結果觀察到 cinnamophilin 與 HDI II 能抑制由LPS所刺激導致的 c-Jun-NH2-terminal kindase (JNK) 表現，但與phosphorylated activation of extracellular signal-regulated kinases (ERKs)並無直接的影響。在細胞移動趨化實驗中，我們觀察到 MCP-1 能誘發 THP-1 細胞的migration 作用。而在有 cinnamophilin 與 HDI II 存在時，MCP-1 所誘發的細胞 migration 作用會被抑制。經由流式細胞儀的測定，我們發現藥物對MMP-9所產生的抑制作用與THP-1細胞表面 b integrin CD11b的變化無關。 用機轉可能主要藉由影響 NF-kB 之訊息傳遞過程。未來我們將進行以 cinnamophilin 與HDI II 為治療目標的活體實驗，期許能更加瞭解它們在活體中對於抗發炎反應的功能與療效。
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基質金屬蛋白酵素(matrix metalloproteinase, MMP)是一種能夠分解細胞外基質蛋白的水解酵素，包括基質與結締纖維組織，因而對於組織之結構重組、修補與破壞都扮演相當重要之角色。同時MMP的含量與活性表現受到許多方式嚴密地調節控制。許多文獻指出，類風濕性關節炎的軟骨組織不正常破壞或粥狀動脈血管斑塊組織的剝離以及癌細胞的生長與惡性轉移皆與異常基質崩解作用有關，其主要原因源自相關細胞(血管內皮細胞、癌細胞、單核球或巨噬細胞)產生及釋放大量MMPs所致。一般而言，發炎性細胞激素以及生長因子等，均會刺激細胞表現MMPs基因及其酵素蛋白之生合成。 在大規模中藥材萃取物及化學合成等藥物成分篩選實驗下，我們發現EM-1及VC-1等藥物，具有抑制MMPs活化之作用。本實驗利用人類臍帶靜脈內皮細胞(HUVEC)的初代細胞與細胞株ECV304為實驗細胞，以生長因子bFGF或氧化性膽固醇7-ketocholesterol為刺激劑，分別以不同濃度處理6小時後，利用電泳酵素分析法(gelatin zymography)發現可增強HUVEC細胞MMPs的活性，特別是在bFGF濃度為20 ng/ml及7-ketocholesterol濃度為20 mg/ml時得到的效果是最明顯，而其中又以MMP-2為主要。然而並無法增強ECV304 MMPs的活性。隨後以此為試驗條件，在電泳酵素分析法下可觀察到EM-1與VC-1等藥物有意義的依濃度效應抑制內皮細胞MMP-2的活性。 從西方墨點法(Western blot)發現MMP-2蛋白質表現量隨EM-1與VC-1濃度增加而降低，故證實此二藥物作用在MMP-2蛋白質表現層次，且可能藉由抑制p38 MAPK的磷酸化來達到抑制MMP-2的效果。另外我們也進行體外血管新生試驗來檢測此二藥物對血管新生作用是否有抑制作用，發現EM-1與VC-1等藥物可抑制內皮細胞在Matrigel中形成類微血管的構造，至於其作用機制是否與抑制MMP-2有關，仍須進一步探討。
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Meclizine (以下簡稱Mec)是一種用來治療頭暈和暈眩的用藥，為抗組織胺藥物的一種。在藥物與細胞的交互作用之中，我們發現Mec會讓人類直腸腫瘤細胞COLO 205誘發細胞凋亡現象。在人類直腸腫瘤細胞COLO 205中，以不同濃度的Mec處理細胞24小時後，觀察到細胞在50mM以上濃度有讓細胞走向細胞凋亡dose-dependent的情形。同時，在顯微鏡之下觀察可以看到隨著Mec藥物濃度增加，細胞數目隨之減少。在流式細胞儀的分析之中，也可以看到處於G0/G1 phase的細胞比例會因著Mec的作用而增加。在以西方墨點法分析各種相關蛋白質的變化之後，關於細胞週期停滯方面我們觀察到p53與p21蛋白在Mec作用之後都會升高，而CDK2和CDK4的活性則受到抑制，這就是Mec造成細胞週期停滯的機轉。在引起細胞凋亡方面，我們看到Mec可以dose-dependently造成以下結果: p53蛋白表現量增加，Bcl-2蛋白表現量減少，Bad蛋白表現量不變，cytochrome C由粒線體釋放到細胞質中，AIF由粒腺體進入細胞核中，Apaf-1蛋白表現量不變，Caspase 9，Caspase 8，Caspase 3活化，PARP被degrade。根據這些結果和文獻的探討，我們提出一個模式圖來解釋Meclizine引起COLO 205細胞走向細胞凋亡和細胞週期停滯的分子機轉。
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Gabapentin (Neurontin) 是一種新的抗癲癇藥物，但是至今作用機轉仍然不清楚。有研究推測gabapentin可以改變血小板對serotonin的代謝或攝取（uptake）；然而，血小板在受刺激凝集的過程是否會受到gabapentin的影響，至今仍未有一套完整的研究加以證實。本研究在in vitro的實驗中發現外加gabapentin確實具有抑制血小板凝集之能力。並且在血小板凝集試驗中發現若事先外加gabapentin，確實有抑制由collagen、ADP、AA等血小板活化劑所引起的凝集作用；隨著血小板活化劑使用種類的不同，gabapentin之IC50約為120μM。本研究係探究gabapentin在血小板活化過程中對細胞內一些訊息傳遞的影響，亦即抑制血小板凝集之機轉。由研究結果發現gabapentin會隨著濃度之增加而有意義的抑制由不同血小板活化劑所引起的人類血小板之凝集現象；gabapentin會抑制由collagen所引起之血小板細胞內phosphoinositol breakdown；gabapentin會抑制由collagen所引起之血小板細胞內鈣離子的增加；再者gabapentin可抑制TxA2之形成，對AA的代謝路徑有所影響。由研究結果發現gabapentin抗血小板活化可能涉及以下路徑：gabapentin可藉由抑制phosphoinositol breakdown的pathway及影響TxA2之形成的pathway，進而影響細胞內鈣離子的移動，最後導致細胞內鈣離子的濃度減少而抑制血小板之凝集反應。 關鍵字：Gabapentin，血小板凝集，phosphoinositol breakdown， TxA2，鈣離子
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一. 研究目的： 本研究在了解惡性肋膜積水經多次胸腔穿刺引流後，對肋膜積水的性質、各種細胞激素(包括TNF-α、IL-1β、IL-5、IL-6、 IL-8)、與纖維蛋白分解相關酵素（PAI-1，tPA）所產生的影響及其臨床上的意義。 二. 實驗材料和方法： 本研究共收集26位具有大量自由流動之惡性肋膜積水且有呼吸困難症狀的病患，作胸腔穿刺引流，每次引流500 mL，連作三天(days 1 to 3)，收集肋膜積水，檢測比較此連續三天肋膜積水的性質、細胞激素及纖維蛋白分解活性之變化。於第六天(day 6) 時，以胸腔超音波檢測肋膜腔內有無纖維蛋白形成，將病人分成兩組，施予肋膜沾粘術，並評估其成效。 三. 結果: 此26位病人之肋膜積水，經連續三天胸腔穿刺引流後，肋膜積水中的TNF-α、PAI-1、IL-8濃度及 neutrophil count呈現有意義增加。 在連續穿刺引流過程中，正向關連(positive correlation)可見於肋膜積水內的IL-8濃度及 neutrophil count (day 1, r = 0.43, p < 0.05; day 2, r = 0.51, p < 0.01; day 3, r = 0.68, p < 0.001)以及TNF-α與 PAI-1 (day 2, r = 0.49, p < 0.05; day 3, r = 0.41, p < 0.05)之間。 在day 6以胸腔超音波追蹤病人肋膜積水情形，有11位產生纖維蛋白沉積(42%,fibrinous group)，其他15位則否(nonfibrinous group)。在連續穿刺引流過程中， fibrinous group病人肋膜積水中的TNF-α與PAI-1濃度呈現有意義增加，且在day 2 及day 3時其數值有意義地高於nonfibrinous group。肋膜沾粘術之成功率，fibrinous group(11/11, 100%)高於nonfibrinous group (8/12, 67%)。 四. 結論： 惡性肋膜積水經多次胸腔穿刺引流後，會引起肋膜發炎及促發炎細胞激素TNF-α的分泌，之後促成PAI-1的釋放，形成纖維蛋白。此纖維蛋白的存在與否，或許可用來預測惡性肋膜積水施予肋膜沾粘術的成效。