大同大學生物工程學系所學位論文
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黑豆漿的內容物中含有大量的蛋白質及多醣類，以及其他的醣包括：水蘇糖、棉籽糖、果糖、葡萄糖及蔗糖。本研究於黑豆漿醱酵過程中,觀察比菲德氏菌的生長及各種醣類的消耗，以及醋酸與乳酸產量的變化。利用下列四株比菲德氏菌：Bifidum BCRC 11844 and 14615, B. adolescentis BCRC 14607 and 14609 對黑豆漿與牛奶於醱酵槽中進行72小時厭氧醱酵。醱酵過程中，監測黑豆漿的寡糖成分的變化、觀察比菲德氏菌的生長以及pH值。此外在牛奶與黑豆漿的72小時厭氧醱酵後，置於4℃、14天，監測生菌數以及pH值的變化。
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豆漿的內容物中含有大量的蛋白質及多醣類，以及其他的醣包括：水蘇糖、棉籽糖、果糖、葡萄糖及蔗糖。本研究於豆漿醱酵過程中，觀察比菲德氏菌的生長及各種醣類的消耗，以及醋酸與乳酸產量的變化。利用下列四株比菲德氏菌：B.bifidum BCRC 11844 and 14615, B. adolescentis BCRC 14607 and 14609 對豆漿與牛奶於醱酵槽中進行72小時厭氧醱酵。醱酵過程中，監測豆漿的寡糖成分的變化、觀察比菲德氏菌的生長以及pH值。此外在牛奶與豆漿的72小時厭氧醱酵後，置於4℃、14天，監測生菌數以及pH值的變化。
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取青脆枝(Nothapodytes foetida)無菌實生苗的葉片、下胚軸為培植體，培養在MS basal salts + 0.5 mg/l BA + 0.5 mg/l 2,4-D建立癒合組織。將葉片癒合組織轉移至MS basal salts + 0.1 mg/l picloram再生不定根，並含有0.059% DW CPT。實生苗頂芽再生植株的根段，培養在MS basal salts + 1.0 mg/l BA + 0.1 mg/l 2,4-D誘導得不定根，含有0.0156% DW CPT，每30天的繼代培養可得到鮮重增加1.67倍。 葉片、下胚軸誘導的癒合組織及根段培植體培養在MS basal salts + 0.5 mg/l TDZ可間接再生不定芽，不定芽經BA誘導芽體抽長，再以IBA誘導發根，得到小植株，循序馴化，可出瓶培養。 取實生苗頂芽再生植株的葉片，經MS basal salts + 1 mg/l BA + 2 mg/l 2,4-D培養5個月，可得到胚性癒合組織。胚性癒合組織轉移到MS basal salt medium不添加生長調節劑，培養10週後開始有體胚發生，少數體胚可正常發育成植株，但多數體胚形態不正常。
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D-amino acid oxidase (DAO)是一種以flavin adenine dinucleotide (FAD)為輔基的flavoenzyme，為製造頭孢菌素類抗生素(cephalosporins)的之先驅物 7- aminocephalosporanic acid的重要酵素。 本研究以帶有Yeast Rhodosporidium toruloides或Trigonopsis variabilis DAO cDNA基因之重組質體的Escherichia coli strain BL21(DE3)，利用不同培養條件來生產DAO。R. toruloides DAO於TB之甘油濃度為1.6% 時，可有較佳活性為73 U/ml；T. variabilis DAO於甘油濃度為1.2% 時，可有較佳活性達89.7U/ml。於LB培養液中添加sorbitol和glycyl betaine，可使R. toruloides DAO活性增為17.7 U/ml，為不添加時的2.8倍；T. variabilis DAO活性增為20.4 U/ml，為不添加時的3.2倍。於TB培養液中添加sorbitol和glycyl betaine，則未能更加提升活性。當以發酵槽培養表現R. toruloides DAO，於誘導後第12小時開始控制pH = 6.8，可於誘導後約22小時獲得較佳活性50.1 U/ml，而T. variabilis DAO則於誘導後第28小時控制pH = 7.0，可於誘導後36小時達到最佳活性79.7 U/ml。
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本研究主要在評估以YM或modified Bisakowski’s formula (MBF) broth培養的Morchella esculenta BCRC 36348與Armillaria mellea ATCC 11113之多醣生產與抗氧化性質。當M. esculenta培養於MBF broth 有最大胞內外多醣，分別為166 mg/g DW與0.275 mg/ml，而A. mellea亦以培養於MBF broth者有較多之胞內外多醣，分別為82.6 mg/g DW與0.731 mg/ml。 抗氧化性質的分析上，則分別量測各樣品的抗氧化力(共軛雙烯)、捕捉DPPH能力、還原力(普魯士藍)和螯合亞鐵離子能力並作比較。抗氧化力方面，熱水萃取物中，以萃自M. esculenta YM培養者最佳，濃度在10 mg/ml時，抗氧化效率可達78.74%；甲醇萃取物中，以萃自A. mellea YM (pH 5)培養者較佳，濃度在10 mg/ml時，其抗氧化效率達91.6%；在胞外發酵液中，以取自A. mellea YM (pH 5)培養者較佳，在濃度5 mg/ml時，抗氧化力達86.5%。捕捉DPPH能力方面，在熱水萃取物中，取自A. mellea兩種培養者皆呈現較高效率，在濃度2 mg/ml時，皆達76 %以上；甲醇萃取物與胞外發酵液中，皆以萃自A. mellea YM (pH 5)培養者較佳，在濃度為5 mg/ml時，分別達95.2%與93.9%。還原力方面，熱水和甲醇萃取物以及胞外發酵液中，皆以萃自A. mellea YM (pH 5)者較佳，還原力(OD700)分別為0.56 (在濃度1 mg/ml時)、0.59 (在濃度1 mg/ml時)和0.81 (在濃度5 mg/ml時)。螯合亞鐵離子能力方面，熱水萃取物中，以萃自A. mellea MBF培養者較佳，在濃度20 mg/ml時，達90%；在甲醇萃取物中，以萃取自M. esculenta MBF培養者較佳，在5 mg/ml時，達91.59%；在胞外發酵液中，以取自A. mellea YM培養者較佳，在濃度5 mg/ml時，達89.84%。四種抗氧化性質中，僅有A. mellea之還原力和多酚量有較明顯的正相關性。
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半乳寡糖能促進腸道中比菲德氏菌和乳酸菌等益菌的增殖，增進人體健康，而受到重視。半乳寡糖是由2至5個單糖所構成的寡糖，其單糖分子主要以半乳糖為主。市售的半乳寡糖主要是利用半乳糖苷酶的半乳糖基轉移活性，將乳糖轉變成半乳寡糖。由於酵素的性質，市售半乳寡糖含有大量的葡萄糖和乳糖，不但半乳寡糖的含量低，而且不利於乳糖不耐症的消費者。本研究主要是用混合酵素系統，亦即半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶，以提高半乳寡糖的產率。其中葡萄糖氧化酶在反應過程中，可將副產物葡萄糖氧化成葡萄糖酸，和碳酸鈣形成鈣鹽沉澱。另外利用酵母菌Kluyveromyces marxianus的醱酵，可將半乳寡糖中的葡萄糖和乳糖等不純物移除，形成接近純度95% 以上的半乳寡糖商品。研究過程中，比較來自Kluyveromyces lactics、Aspergillus oryzae以及環泰公司的半乳糖苷酶，其中以環泰公司的酵素能夠產生較多的半乳寡糖。而混合酵素系統將半乳寡糖的產率由25% 提高至28 %。而經由酵母菌Kluyveromyces marxianus的醱酵，則可將半乳寡糖的乾重純度由25 % 提高至96 %。
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極端嗜鹽菌Haloferax mediterranei，能於菌體內累積儲藏性的聚脂 – polyhydroxyalkanoate (PHA)。研究中發現，在重複饋料培養下，以擠壓米糠玉米澱粉和酵母萃取物分別做為碳、氮源饋料，雖可得相當高菌體(110 g/l)與PHA(60 g/gcell)產量，但其成本高且培養過程不穩定，不易控制。所以利用連續式醱酵策略進行培養生產高分子，在稀釋速率為0.03 h-1的連續醱酵中，饋料液以大豆水解液取代酵母萃取物做為氮源培養下，不僅可降低生產成本，且菌體濃度和高分子含量分別可維持連續生產83 g/l和50 %。以此數據進行工廠生產流程設計和經濟評估分析，發現在目前市場所預估之初期生產規模為2800噸/年產量下，PHA之生產成本估計為4.8 US$/kg，而如果以全球量產規模在50000噸/年，則生產成本可預期降至3.74 US$/kg。若與目前昂貴的醫療用生物分解性高分子，如PLA (poly lactic acid)來比較，則PHA在生醫材料市場競爭性具有相當大的潛力。
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本研究利用嗜鹼性芽胞桿菌（Bacillus circulans No. 38-2，BCRC 10094）進行醱酵生產CGTase的研究。分別使用玉米澱粉和可溶性澱粉為碳源，能夠有效的誘導生產CGTase。而澱粉同時扮演碳源與誘導劑的功能。在33 C下，以基礎培養基與澱粉20 （g/L）為碳源的批式醱酵能生產約17319 Unit/ml的酵素活性。在pH-stat的饋料批式醱酵培養中，以澱粉的培養基，能夠得到約63165 Unit/ml的酵素活性。若先以葡萄糖為碳源將細胞的濃度提高，然後再饋入澱粉來誘導酵素，則能得到約39500 Unit/ml的酵素活性。在連續式醱酵培養的操作條件下，以稀釋率0.15倍進行CGTase的生產，結果能得到 31722 Unit/ml的酵素活性，以稀釋率0.3倍進行 CGTase的生產，則能得到約14320 Unit/ml的酵素活性。本結果顯示，利用pH-stat的饋料批式醱酵培養，在以澱粉為碳源的條件下，能夠得到最大量的酵素活性。若以單位體積產率（volumetric productivity）看則以連續式醱酵在稀釋率為0.3倍時，得到的酵素活性最高（約2864 Unit/h/L），其次為連續式醱酵在稀釋率為0.15倍（約2379 Unit/h/L），以pH-stat 饋料批式醱酵及批式醱酵以澱粉為碳源的體積生產速率分別為 （638, 444 Unit/h/L）。
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納豆激酶（nattokinase, NK）具有很強的血纖維蛋白（fibrin）溶解能力。它主要是利用枯草桿菌（Bacillus subtilis）的類緣菌，俗稱「納豆菌」。NK是屬於一種絲胺酸蛋白酶（serine protease） ，可運用於血栓症、中風等心血管疾病的預防及治療。 本研究利用一株來自納豆食品中篩選的北海道納豆菌，以500 ml的三角錐瓶內含200 ml基礎培養基，進行以醱酵培養生產NK之研究。最後以糖蜜（20 g/L）、peptone（20 g/L）、MgSO4（1 g/L）、CaCl2（1 g/L）和K2HPO4（2 g/L）為培養基，在醱酵溫度37℃，轉速180 rpm，培養47.5小時會有最高活性(63 unit)。酵素最適pH 值及溫度分別為10與37℃。pH-stat的饋料批式醱酵方式，初期以molasses為主要的碳源，之後的饋料主要是增加細胞濃度為主，有如此大量菌體就可產生較多的酵素。由於連續提供養分使的菌得以長時間生長及分泌酵素，最後的細胞濃度比以三角錐瓶醱酵培養增加了3倍，而酵素的活性也比三角錐瓶醱酵培養提高了2.7倍，酵素活性約為172 unit。
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本實驗乃利用蒙脫土bentonite初步純化甘藷之胰蛋白酶抑制劑sporamin之研究，並將其與硫銨沉澱之結果做探討與比較。實驗結果發現：在45%的硫銨沉澱純化下可獲得活性回收率 10.4 %的sporamin，純化倍數為1.11；由蒙脫土純化，約可吸附75-80 %蛋白質，活性回收率為62 %，純化倍數為1.77。硫銨沉澱需反應8小時或過夜，而利用蒙脫土只需要於pH=6.5，25℃下反應一小時即可完成吸附，並可在pH=10，4℃下，以0.1M AlK(SO4)2反應3小時即可完成脫附，可脫附35 %的蛋白質，活性回收率為62 %。實驗結果並顯示出在甘薯液為5 mg/ml的濃度下時，每克的蒙脫土，約可吸附66毫克的蛋白質；利用蘭格謬爾 (Langmuir adsorption isotherm model)公式計算出來的最大吸附量 qmax= 236 mg/g，以及Langmuir常數KL= 10 mg/ml，並可利用這些計算出的數值，應用於計算工業生產時之DBC (單位體積的固定床之動能鍵結能力)所需的條件。1997年，Dr.Yeh等人將sporamin轉殖於菸草中發現對斜紋夜盜蛾等幼蟲的啃食具有抗食性，因此sporamin經由初步純化後，可應用於生物農藥上。蒙脫土為一價格便宜之自然界礦土，在使用上不具有類似硫銨排放後，造成河川污染之環保問題；並在操作及反應時間上較硫銨沉澱來的方便而快速，並可降低生物農藥之成本。