中山醫學大學生化微生物免疫研究所學位論文
中山醫學大學,正常發行
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目的: 類風溼性關節炎(RA)與牙周病(PD)關係密切，兩者的病徵很類似 都是慢性發炎造成關節或是齒槽骨的損傷。有研究指出類風濕性關節 炎的病患罹患牙周病的比率比起其他人約高出兩倍。造成牙周病的主 要致病菌牙齦卟啉單孢菌(Porphyromonas gingivalis)有許多毒理因子 不但可以引起發炎反應，甚至可以幫助細菌躲避免疫系統的攻擊，其 中一重要的毒理因子: Arg-gingipain A (RgpA)已經被證實可以分解宿 主的免疫球蛋白、補體、以及細胞激素等，並且會造成血管通透性增 加進而加劇發炎反應。本研究想藉由偵測類風濕性關節炎以及其他自 體免疫病患血清中是否有抗RgpA抗體以及觀察病情嚴重程度是否與 抗體效價有關連。 材料與方法: 利用molecular cloning 技術將Porphyromonas gingivalis 之RgpA 蛋白分成酵素活性區(catalytic domain)以及血球凝集區(hemagglutinin domain)分別大量表達後純化，再以酵素免疫分析法(ELISA)分析90 位類風溼性關節炎(rheumatoid arthritis, RA)、38 位全身性紅斑性狼瘡 (systemic lupus erythematosus, SLE)、15 位非RA、SLE 之自體免疫病 患以及11 位對照組(normal control)血清內是否含有抗hemagglutinin domain 或抗catalytic domain 之抗體。 結果: 實驗結果發現共有40 位病人有抗RgpA hemagglutinin domain 的 抗體，0 位病人有抗RgpA catalytic domain 抗體。其中90 位RA 病人 中有29 人帶有抗RgpA hemagglutinin domain 抗體(32.2%)，38 位SLE 病人中有6 人帶有抗RgpA hemagglutinin domain 抗體(15.8%)，15 位 非RA、SLE 之自體免疫病人中有5 人帶有抗RgpA hemagglutinin domain 抗體(33.3%)。在RA 病人群中，抗RgpA hemagglutinin domain 抗體陽性比率明顯高於對照組(p＜0.05)，而所有族群之抗RgpA catalytic domain 抗體與對照組相比則無統計學上的意義(p＞0.05)。 結論: 我們首次偵測及分析自體免疫病人中抗RgpA 蛋白之抗體情形。 結果顯示RgpA catalytic domain 可能較不具抗原性，所以在所有人的 血清中都無法偵測到特異性抗體存在。而在RgpA hemagglutinin domain 方面，RA 病人中帶有RgpA hemagglutinin domain 抗體的陽性 比率明顯高於對照組及其他族群，這也和先前其他團隊研究RA 病人 較容易罹患牙周病結果一致，未來需進一步釐清RgpA 如何參與RA 之致病機轉。
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第二型轉麩胺酶（transglutaminase 2；TG2）為一多功能蛋白，具有轉麩胺酶活性、G蛋白活性、雙硫異構酶活性以及蛋白質激酶活性。在細胞中主要位於細胞質，但是亦分佈於細胞核、細胞膜、細胞表面，甚至可以分泌到細胞外。位於細胞表面的第二型轉麩胺酶可與integrin作用，進而促進細胞黏附。近來的文獻更進一步指出第二型轉麩胺酶與癌細胞的轉移有關。在此，我們使用高轉移性肺癌細胞株CL1-5及低轉移性細胞株CL1-0去探討第二型轉麩胺酶在肺癌細胞轉移中所扮演的角色以及控制其表現之機制。我們的結果顯示，降低第二型轉麩胺酶的表現量，或者在細胞培養時加入第二型轉麩胺酶抗體CUB7402會抑制CL1-5的移行和侵入。然而，加入第二型轉麩胺酶活性抑制劑對CL1-5的侵入和移行能力沒有影響。因此，第二型轉麩胺酶對肺癌細胞移行和侵入能力可能受其數量或分布所影響，而與活性無關。第二型轉麩胺酶在CL1-0的表現量可以由同時處理5-Aza-2’-deoxycystidine and trichostatin A或是分別刺激過氧化氫或腫瘤壞死因子而提高。但是，第二型轉麩胺酶在CL1-5的表現量僅能些微地被pyrrolidine dithiocarbamate或genistein降低。
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克雷白氏肺炎桿菌可適應環境變化並具有引起多樣化的臨床感染的能力, 究竟克雷白氏肺炎桿菌如何轉換調節生理機制以允許其在特定環境中生存仍然是個謎團。近來研究證實小RNA在原核細胞適應多樣的環境變化中扮演著重要調控角色。實驗室先前的研究發現了RybB, 這個克雷白氏肺炎桿菌的sRNA, 在Sigma E大量表達的克雷白氏肺炎桿菌中, 隨之大量增加其表現量。Sigma E的缺失除造成克雷白氏肺炎桿菌的毒性喪失外亦會減損其在不同極端環境下的抗壓性。雖然Sigma E是轉錄活化因子, 全基因組DNA微陣列分析顯示在克雷白氏肺炎桿菌有45%的Sigma E-dependent的基因受到負向調控。由於RybB是可以在後轉錄的作用下來抑制基因表現, 負向調控Sigma E-regulon的基因可能是源自於RybB的後轉錄抑制作用。本研究的主要目的在於探討RybB如何在後轉錄層次上調控克雷白氏肺炎桿菌的生理與毒性。利用同源重組的技術將RybB基因剔除得到突變菌株ΔRybB。相較於野生型菌株,ΔRybB感染BALB/c小鼠的能力顯著降低。全基因組DNA微陣列分析顯示有31個克雷白氏肺炎桿菌基因在RybB的短時間脈衝表現下, mRNA的量相較於對照組顯著減少四倍以上。運用在E. coli TOP10中的Two-plasmids系統, 以偵測GFP轉譯融合蛋白的方式, 推測RybB可能可藉由干擾RNA聚合酶結合的方式負向調控GalU、OmpC、HdeB、和KP1_0760的轉譯作用。這些結果代表著RybB的負向調控可以微調克雷白氏肺炎桿菌的外膜、莢膜和抗酸蛋白的表現而影響細菌的致病力, 因此是非常重要而值得探討的因子。
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JC病毒屬於人類多瘤性病毒科，會感染免疫缺陷病人的腦部寡突膠細胞，造成進行性多病灶腦白質症。JC病毒的主要結構蛋白VP1在大腸桿菌的蛋白表達系統中會自行組裝成類病毒殼體，並可包裹外來的DNA，因此嘗試將JC病毒的類病毒殼體當作基因輸送的載體，遞送外來基因到人類細胞。在本論文中，以大腸桿菌製造包裹自殺基因的類病毒殼體，再以此類病毒殼體感染人類肺腺癌細胞。在體外實驗中，攜帶自殺基因的類病毒殼體再配合Ganciclovir作用可以毒殺人類肺腺癌細胞。在裸鼠模式中，與控制組相比較下，腫瘤成長的幅度比較小。因此，JC病毒的類病毒殼體有可能發展成為治療人類肺腺癌的基因傳遞載體。
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克雷白氏肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae) 屬於革蘭氏陰性腸內桿菌科(Enterobacteriacea)，為造成社區感染和院內感染常見的病原菌，會導致肺炎，腦膜炎，尿道感染和化膿性肝膿瘍。目前已知K. pneumoniae的致病毒力因子，包括莢膜(capsule)，脂多醣體(lipopolysaccharides,LPS)，黏附因子(adhesion factor)，血清抵抗能力(serum resistance)，以及鐵螯合系統(iron acquisition system)等。最近有一種新型的蛋白質分泌系統被稱為第六型蛋白質分泌系統(Type VI protein secretion system,T6SS)，存在於許多動植物的病原細菌中。目前T6SS的詳細機制仍不清楚，但在許多動物模型中看到細菌藉由第六型蛋白質分泌系統感染宿主。在本研究中，為了探討T6SS在K. pneumoniae毒性中所扮演的角色，我針對T6SS中的重要基因，包括hcp，vgrG，clpV，以及icmF製備單基因與多基因的基因剔除菌株。在肝膿瘍的小鼠模式中，接受T6SS基因剔除的菌株感染的小鼠具有較高的存活率，而且在肝臟和其他器官散布的菌量也是較低的。這個結果顯示T6SS在K. pneumoniae 的毒力上扮演重要的角色。此外，T6SS基因剔除的菌株感染BNL細胞株時，細菌黏附細胞的能力以及細胞毒殺力與野生型菌株相比亦有下降的趨勢。雖然，T6SS是K. pneumoniae毒性表現所必須的因子之一，但更深入的機制仍需要進一步實驗探討。
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金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一種能引起人類各種疾病的常見格蘭氏陽性球菌，抗甲氧苯青黴素金黃色葡萄球菌methicillin resistant S. aureus，簡稱MRSA不但造成院內和社區感染，更因獨特的抗藥性導致罹病率與死亡率的增加。本研究企圖探討金黃色葡萄球菌的臨床菌株表現型與基因型特徵的分佈情形。因此，我們收集中山醫學大學附設醫院57株自血液分離出的金黃色葡萄球菌，使用分子生物學的方法，包括Multiplex PCRs、spa、agr、和dru偵測菌株基因型；而以自動化儀器、agar dilution方法偵測最低抑菌濃度試驗minimum inhibitory concentration (MIC)，藉以瞭解金黃色葡萄球菌的表現型結果。本研究結果顯示，分子生物學的方法可以清楚的分出社區型community acquired MRSA (CA-MRSA)和院內型hospital acquired MRSA (HA-MRSA)，而臨床表現型卻發現有八株MRSA，對oxacillin的MIC呈現感受性，必須藉由cefoxitin辨別；然而，其中三株 MRSA 不但 oxacillin 的MIC呈現感受性，cefoxitin也具感受性。這種容易造成臨床誤判的菌種，臺灣也有學者發表相同的發現，但不同的是本研究只有一株是CA-MRSA，另兩株卻為HA-MRSA。 本研究充分反映金黃色葡萄球菌的臨床菌株表現型與基因型的差異，藉助各種分子生物學的基因型偵測可以輔助臨床實驗室未臻完美之處，更提供了解金黃色葡萄球菌抗藥性演化的線索。
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胚胎幹細胞是具有自我更新與分化三大胚層及各式體細胞的獨特能力 (多能性) 。了解胚胎幹細胞的自我更新以及多能性的機制對於發育學，再生醫學等是非常重要的。呂老師實驗室以4801種不同的short hairpin RNA (shRNA) 進行高通量功能性篩選，以尋找與老鼠胚胎幹細胞自我更新或分化有關的kinases 或phosphatases。我們發現了132個並未曾在胚胎幹細胞中被研究過的kinases與phosphatase可以調控老鼠胚胎幹細胞自我更新或分化。其中兩個基因分別是Protein Tyrosine Phosphatase Non-receptor 7 (PTPN7) 與Uridine-Cyditine Kinase 1 (UCK1)。我們以二個不同的shRNA 抑制PTPN7或UCK1的表現 ，研究結果發現，抑制PTPN7以及UCK1會導致胚胎幹細胞的分化、細胞數量大量下降、並抑制與幹細胞自我更新有關的標誌蛋白或樞紐蛋白如Oct4、 Sox2、 Nanog、pSTAT3、STAT3、pAKT、AKT、pERK、和 ERK的表現。這些發現顯示了PTPN7和UCK1在調控胚胎幹細胞中扮演著不可或缺的角色。
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缺血性中風是造成成人死亡的第二大死因，並且會引起嚴重的認知及運動功能的退化、神經退化性疾病及猝死的發生。缺血性中風會造成細胞面臨缺氧缺糖的環境，使細胞因為缺氧缺糖而啟動自體吞噬 (autophagy) 、細胞凋亡 (apoptosis) 、壞死 (necrosis) 等路徑。已知在缺血性中風中，自體吞噬扮演著一個很重要的角色，但是否為保護機制或加劇腦損傷至今仍具爭議。桑黃 (Phellinus linteus) 為一種橘色的多年生蕈類，被認為具有抗氧化、抗發炎等特性，但將桑黃使用在中風疾病的研究並不多。在本研究中，以氧糖剝奪(oxygen glucose deprivation, OGD)/復氧 (OGD reoxygenation, O/R) 來模擬活體中腦部缺血再灌流 (ischemia/reperfusion)的狀況，偵測桑黃菌絲體萃取物是否保護類神經細胞株免於OGD或OGD/R的傷害。在結果中發現，低濃度的桑黃菌絲體萃取物能夠保護PC-12類神經細胞免於氧糖剝奪或氧糖剝奪/復氧所造成的傷害，細胞死亡率從70%降至5%。相較於在OGD時不給予桑黃菌絲體萃取物的組別，給予桑黃菌絲體萃取物的PC-12細胞中p62、Beclin 1及LC3 I蛋白質的表現有顯著的增加，並維持PC-12細胞中自體吞噬的進行；另外，在氧糖剝奪實驗中，低濃度的桑黃菌絲體萃取物能增加Bcl-2蛋白質的表現，且明顯的抑制pro-caspase 3的活化；桑黃菌絲體萃取物能有效抑制JNK及eIF-2α的磷酸化，避免啟動細胞走向凋亡路徑。此外，，在氧糖剝奪實驗時，桑黃菌絲體萃取物能誘導表現CHOP蛋白質。然而，結果中也發現cycloheximde (CHX) 不影響自體吞噬相關蛋白的表現，卻能抑制CHOP蛋白質的表現，在此我們認為CHOP蛋白質的表現很可能與p38的活化有關但並不影響LC3 I蛋白質的表現。綜合以上，我們認為桑黃菌絲體萃取物可維持細胞的自體吞噬、抑制促凋亡訊號及抑制細胞凋亡來保護類神經細胞免於受到氧糖剝奪及氧糖剝奪/復氧所誘導的細胞損傷。因此，未來桑黃可能提供一個新的策略來預防中風。
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前言：IL-1beta在退化性關節炎患的發病過程，扮演發炎重要的角色，IL-1beta在軟骨組織能誘發趨化因子 (IL-8, MCP-1, IP-10)，分別能吸引並活化嗜中性白血球、單核球細胞及毒殺性T淋巴細胞，涵蓋先天及後天免疫，影響病程的進展，這些基因可能由不同的訊號傳遞路徑所調控，另一方面IL-1beta能提高細胞鈣離子的活化，鈣離子的濃度能影響訊息傳遞路徑及基因表現，也可能影響細胞的存活及退化性關節炎疾病的發展。而葡萄糖胺(glucosamine)能夠減緩退化性關節炎患者疼痛感及發炎反應，但其抗發炎機制還未完全明瞭。 研究目的：本篇研究在探討葡萄糖胺的抗發炎機制，是否對於IL-1beta誘發細胞質鈣離子活化、以及相關訊息傳遞路徑(包括CaMK-II、MAPK磷酸化)有抑制作用，並探討glycogen synthase kinase 3beta (GSK-3beta) 在其中扮演的角色。 實驗方法：在SW-1353細胞中加入葡萄糖胺(glucosamine)和細胞激素IL-1beta，利用Fura-2AM (Fura-2 acetoxymethyl ester) 測定鈣離子濃度的變化；以Western blot來分析ERK、p38以及CaMK-II磷酸化程度。 結果：葡萄糖胺會抑制IL-1beta所誘發鈣離子的驅動，並導致細胞中鈣離子濃度下降以及ERK、CaMK-II、p38的磷酸化下降。在GSK-3beta的抑制劑LiCl存在下，能減輕葡萄糖胺對於IL-1beta所引發的發炎反應(包括鈣離子活化，及MAPK磷酸化)的抑制作用。在葡萄糖胺抑制IL-1beta誘發發炎反應中，Ionomycin能補充細胞質鈣離子濃度，也能恢復IL-1beta所誘發的ERK、CaMK-II的磷酸化程度，相反的卻造成p38磷酸化更為減弱。 討論：臨床上葡萄糖胺的抗發炎作用除了和其抑制IL-1beta所誘發NFĸB的活化有關之外，本篇的研究發現可能也和其抑制鈣離子驅動及MAPK活化有關，結果顯示葡萄糖胺可能引發全面性的抑制作用，而非專一性的抑制單一路徑。而這些抑制作用可能是藉由GSK-3beta所調控。GSK-3beta活化可能抑制鈣離子驅動，進而影響ERK及CaMK-II的活化；另一方面透過其他機制，抑制p38的活化。
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疱疹病毒 (Herpes simplex virus; HSV)感染對於人類的健康具有相當程度的危害，當免疫力低下的患者受到此病毒感染可能會引起許多嚴重的疾病並可能會導致較高的致死率。由於HSV對人具有高度的傳染性，因此常以同為阿爾發疱疹病毒亞科之假性狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)來模擬HSV的感染。杜莎藻(Dunaliella salina)是一種嗜鹽性、微小單細胞生物(無細胞壁)其包含豐富的類胡蘿蔔素(特別是all-trans β-carotene 和 9- 或 9‘-cis-β-carotene)，目前已經被拿來應用在保健食品。在過去的研究中已經發現杜莎藻具有良好的抗細菌性內毒素(LPS)所誘導巨噬細胞(RAW264.7)之發炎反應。本論文的研究，利用假性狂犬病毒感染RAW264.7細胞所誘發炎症反應的模式，探討杜莎藻是否具有調節病毒感染所引起的炎症反應。我們將RAW264.7細胞預先添加杜莎藻(100 μM)1.5小時後，在感染0.1 MOI 的PRV，並於不同時間點收集上清液及細胞萃取物，再利用ELISA及western blot等方法來檢測NO與發炎相關細胞激素的作用機制。由ELISA的實驗結果發現杜莎藻確實能抑制由PRV感染後所誘發的NO且能降低IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1等發炎相關細胞激素的表現。經western blot的實驗結果，發現杜莎藻可藉由NF-κB pathway (如: NF-κB p50、NF-κB p65、IKK、JNK以及P38)與 IL-6 pathway(如: JAK-2, p-JAK-2, STAT-1/3, p-STAT-1/3) 來抑制NF-κB的活化，降低iNOS與COX-2表現，進而抑制炎症反應。因此我們也利用上述路徑的各種蛋白抑制劑(P38、ERK、JNK、STAT-3、JAK)來確認PRV所誘導炎症反應的路徑，結果顯示除了ERK抑制劑之外，其他的抑制劑(P38、JNK、STAT-3、JAK)確實能夠抑制PRV所誘導的NF-κB、iNOS與COX-2表現，達到抗發炎的作用。綜合上述的實驗結果可知，杜莎藻不只能抑制細菌性的發炎反應，同時也具有抑制病毒感染後所造成的發炎反應。