- 學位論文
利用經表面修飾之竹炭設計高專一性之細胞篩選器應用於單株抗體製造之研究
Surface Modification of Bamboo Charcoal as a Template of High-through-put Cell Sorter for Monoclonal Antibody Production
摘要
單株抗體的製備在1975年由George Kohler和Cesar Milstein成功利用細胞融合的技術製造出來後，廣泛被運用，然而在操作流程上較為繁瑣，尤其是單株化選殖的過程，不僅需花費大量時間，同時也必須消耗很多的人力，而操作者的熟練度也會影響結果，因此往往實驗之成敗決定於此步驟。 因此，本研究之主要目的在於希望開發出一組高專一性的細胞篩選器(high-through-put cell sorter)，期望不僅能夠縮短單株化選殖之時間，也能夠讓單株抗體的製備步驟單一化(one step)，以利操作者的使用並節省單株抗體的生產時間。 細胞篩選器利用本實驗室開發出來的虹吸式生物反應器(cytoflow-bioreactor)為主體，配合carrier的選用，希望能讓具特異性的融合瘤細胞製備步驟單一化。 為了讓細胞篩選器能夠穩定的操作，在carrier的選用上，本研究論文選擇竹炭(bamboo charcoal)作為carrier，屏除過去常用的磁珠、玻璃珠…等，主要是由於這些材料進行表面改質接枝生物分子時，常利用其表面的氫氧基(hydroxyl group)來與生物分子相接，因此往往使用HMDI或是aminosilane來進行生物分子的接枝。而HMDI對水敏感，容易與水反應，因此，接枝過程必須保持乾燥，一旦水分進入反應槽，反應即終止；至於利用aminosilane進行接枝後，產物在水溶液中有水解斷鍵的疑慮，因此材料並不夠穩定。此外，這些材料的比表面積均不若竹炭來的多。 至於竹炭表面具有豐富的C=C鍵，容易進行酸處理產生(carboxyl group)而與生物分子(purified human EGFR)穩定以醯胺鍵結(amide bond)相接；另外竹炭表面也具有高度孔洞，可以提供相當高的比表面積接枝生物分子(human EGFR)，進而增進細胞篩選器的效能，提高細胞篩選器的靈敏度，並且希望藉由孔洞的形狀而能讓B細胞與骨髓瘤(myeloma)細胞有更靠近的機率，而增加細胞融合成功的比率，以產生更多專一性的融合瘤細胞(specific hybridoma cell)，進而分泌單株抗體。 由Raman spectrum可了解藉由硝酸處理能夠使竹炭結構中的C=C鍵氧化而被破壞；並進一步利用FT-IR圖譜可得知利用硝酸處理能讓竹炭表面產生酸基(carboxyl group)；而免疫螢光分析(IFA)中可證實經由硝酸處理的竹炭可以藉由EDC/NHS來與purified human EGFR以共價鍵(amide bond)穩定相接；此部份之結果亦可經由熱重分析儀(TGA)來獲得佐證。 由SEM以及OM圖可以推測本研究欲開發出來之「高專一性細胞篩選器」確實能夠抓到B細胞，並進一步能夠與骨髓瘤細胞融合成融合瘤細胞；再利用ELISA來分析”有抓到B細胞之竹炭”是否能夠分泌IgG以及定量其分泌的含量；而在免疫螢光分析(IFA)之數據則可得之融合瘤細胞(有抓到B細胞之竹炭)能夠於培養過程中分泌Mouse anti-human EGFR antibody。 在未來，除了希望讓本研究開發出來之細胞篩選裝置能夠更加穩定操作外，更希望能夠有機會應用於人類單株抗體的製造上。
並列摘要
George Kohler and Cesar Milstein employed fusion theory to produce monoclonal antibody in 1975. An attempt was made in order to increase the mAb production by a high-through-out cell sorter in subcloning (selection step). A siphon bioreactor (cytoflow-bioreactor) and the new material (bamboo charcoal) combined as a cell sorter called “high-through-put cell sorter”. The advantage of the high-through-put cell sorter was reduced time-comsuming, labor-intensive, cost-effective and animal-reducing for monoclonal antibody production. The feasibility of the high-through-put cell sorter was tested with A549 cell as the model antigen, due to the high expression of the “epidermal growth factor receptor, EGFR” on the membrane of the A549 cell. The results of Raman spectrum revealed the oxidation of bamboo charcoal might be because of the usage of nitric acid or acid mixture (nitric acid/sulfuric acid: 1/3). From the FT-IR, we could further analyze the introduction of carboxyl group on the surface of bamboo charcoal. The IFA confirmed that we could conjugate purified human EGFR on the surface of the acid-treated bamboo charcoal by forming an amide bond using EDC/NHS and those results were further confirmed by TGA. In SEM, the conjugation of purified human EGFR on the acid-treated bamboo charcoal surface captured the splenocytes (B cells) from immunized mice. The results of ELISA monitored the IgG secretion from the supernatant of the bamboo charcoal binding with hybridoma cell cultured medium. Thus it was confirmed that it could secrete anti-human EGFR antibody in the supernatant of the cultured bamboo charcoal binding with hybridoma cell from IFA. In the future, this “high-through-put cell sorter” could be also employed to harvest antibody-secreting B cells from the peripheral blood without sacrificing the animals and also expected to produce humanized monoclonal antibody.
參考文獻
延伸閱讀
- 翁欽暉（2009）。經修飾過竹炭作為多功能免疫分析材料應用於人類血清之研究〔碩士論文，國立臺灣大學〕。華藝線上圖書館。https://doi.org/10.6342/NTU.2009.01209
- 趙佳鴻、劉芳麟、王照仁、白桂芳（2020）。竹嵌紋病毒鞘蛋白抗血清之製備及其於病毒檢測之應用。臺中區農業改良場研究彙報，(147)，75-88。https://www.airitilibrary.com/Article/Detail?DocID=P20130930003-202006-202103240015-202103240015-75-88
- 陳豪麟（2011）。製備磁化竹炭發展高效率的細胞篩選器應用於單株抗體生產之研究〔碩士論文，國立臺灣大學〕。華藝線上圖書館。https://doi.org/10.6342/NTU.2011.02847
- 劉正字、李文昭、王恩華（1993）。竹材積層膠合製作高級製品－數種竹材積層膠合用膠合劑之特性及其膠合強度變化之探討。林產工業，12(3)，51-63。https://doi.org/10.6561/FPI.1993.12(3).4
- 王意凱（2012）。The study of bamboo charcoal pyrolysis reaction〔碩士論文，國立中正大學〕。華藝線上圖書館。https://www.airitilibrary.com/Article/Detail?DocID=U0033-2110201613524668