S100B與其交互作用蛋白STAMP2在糖尿病腎病變的角色

Roles of S100B and its interaction with STAMP2 in diabetic nephropathy

莊詔棠(Chao-Tang Chuang)

指導教授 ： 莊麗月

高雄醫學大學/醫學院/醫學研究所博士班/博士(2015年)

摘要

高度糖化終產物(AGE)及其受器(RAGE)會誘發乙型轉型生長因子(TGF-b)，細胞肥大及細胞外間質堆積而造成糖尿病腎病變。RAGE結合到許多AGE以外的配體如S100B蛋白質(S100B為S100/calgranulin家族系列蛋白質)，先前研究發現S100B會刺激小鼠腎間質細胞株(MES 13 cells)增加TGF-b、fibronectin及ERK1/2與p38 kinase，也有研究發現糖尿病小鼠的腎絲球中S100B mRNA有增加，但是目前S100B在糖尿病腎病變的角色仍未知，因此我們研究S100B在高糖培養MES 13細胞株及streptozotocin誘導的糖尿病小鼠中所扮演的角色。
高糖呈現時間效應(24∼72小時)的促進S100B蛋白質與mRNA的表現，也呈現時間效應(24∼72小時)的增加細胞培養液中的S100B蛋白質。高糖在24小時會促進細胞增生，在48∼72小時則會抑制細胞生長，而S100B蛋白質在12小時會促進細胞增生，在24∼72小時也會抑制細胞生長。高糖在48∼72小時會造成細胞肥大，S100B蛋白質在24∼72小時也造成細胞肥大。因此我們進一步觀察細胞生長週期相關蛋白質的表現，我們發現高糖在12小時促進cyclin D1與CDK4蛋白質的表現，在24小時促進p21WAF1與p27Kip1蛋白質的表現。 S100B在8小時促進cyclin D1的表現，在12小時促進p21WAF1與p27Kip1蛋白質的表現。高糖與S100B在 24∼72小時促進CTGF、collagen I、collagen IV與fibronectin蛋白質的表現，高糖與S100B蛋白質在24∼72小時促進TGF-?猁漯穛{與生物活性，而且S100B蛋白質是透過ERK1/2、p38與TGF-?? receptor來調控TGF-b的表現。S100B蛋白質會活化ERK1/2、p38、JNK、Akt、JAK/STAT、TGF-b/Smad pathway並且會抑制Wnt pathway。高糖與S100B蛋白質在作用24∼72小時下具時間效應的促進p65與c-Jun轉錄因子而來共同調控cox-2發炎蛋白質的表現。我們利用siRNA技術證明在MES13細胞株中高糖作用所造成的細胞肥大、細胞外間質堆積與發炎反應需要透過S100蛋白質來進行調控，而在糖尿病小鼠的實驗中發現S100B antisense oligonucleotides則能逆轉糖尿病小鼠腎絲球細胞外間質的堆積，而S100B overexpression plasmid則會造成小鼠腎絲球細胞外間質堆積。
STAMP2 (six transmembrane protein of prostate 2, STEAP4, TIARP)是一種抗發炎蛋白質，STAMP2蛋白質在細胞膜與caveolin並存, 而caveolin是RAGE存在的地方，因此STAMP2在可能會與RAGE或其配體(例如：S100B)交互作用，先前有研究發現在缺乏STAMP2的脂肪細胞中高糖能促進IL-6，而STAMP2基因剃除小鼠會發生高血糖和發炎現象，但是STAMP2基因轉殖小鼠則會改善動脈粥狀硬化，然而STAMP2在糖尿病腎病變的角色仍未知，因此我們研究STAMP2蛋白質在高糖或S100B蛋白質培養MES 13細胞及streptozotocin誘導的糖尿病小鼠中扮演的角色。
高糖與S100B蛋白質都呈時間效應(24∼72小時)的經由增加S100B蛋白質來促進細胞膜(但非細胞質)STAMP2蛋白質的表現，我們利用免疫沉澱法與液相層析質譜儀發現在MES 13細胞株中STAMP2蛋白質會與S100B蛋白質進行蛋白質交互作用，但是STAMP2不與RAGE進行蛋白質交互作用，因此STAMP2蛋白質與RAGE會在細胞膜上競爭與S100B蛋白質的結合。我們透過siRNA技術發現高糖促進STAMP2蛋白質的表現需經由S100B蛋白質活化JNK、Akt以及JAK/STAT訊息傳遞路徑調控STAMP2蛋白質的表現。由於STAMP2 promoter有3個STAT3的結合位，我們發現對MES 13細胞株處理高糖與S100B蛋白質所活化的STAT3會結合在 STAMP2 promoter上的結合位，其中以第二個結合位對STAMP2蛋白質的調控最為重要。此外我們使MES 13細胞株大量表現STAMP2蛋白質並以高糖及S100B蛋白質作用48小時，發現大量表現的STAMP2蛋白質能逆轉高糖與S100B蛋白質促進p21WAF1與p27Kip1蛋白質的表現與細胞肥大，也能逆轉高糖與S100B蛋白質促進的CTGF、collagen I、collagen IV與fibronectin等蛋白質與細胞外間質的堆積，並且能逆轉高糖與S100B蛋白質所促進的TGF-?猁穛{與生物活性以及逆轉p65與c-Jun轉錄因子以及兩者共同調控的cox-2發炎蛋白質的表現。大量表現的STAMP2蛋白質也能抑制高糖所促進的S100B蛋白質表現，並逆轉S100B蛋白質所活化的訊息傳遞路徑。我們也發現注射STAMP2 overexpression plasmid的糖尿病小鼠能逆轉腎絲球中collagen I、collagen IV、fibronectin、S100B、TGF-b、cox-2、p-ERK1/2、p-Akt以及p-STAT3的表現。
在腎間質細胞株(MES 13 cells)中，S100B蛋白質經由 ERK1/2及p38 kinase促進TGF-?猁漯穛{，高糖也經由S100B蛋白質來增加腎臟纖維化的蛋白質(如：TGF-b、collagen I、collagen IV及fibronectin)與細胞肥大相關的p21WAF1與p27Kip1蛋白質，因此S100B蛋白質在糖尿病腎病變中扮演重要的角色。高糖經由S100B蛋白質活化JNK、Akt與STAT3來促進細胞膜(但非細胞質) STAMP2蛋白質的表現。STAMP2蛋白質與S100B蛋白質進行交互作用，而大量表現的STAMP2蛋白質能抑制高糖所促進的S100B蛋白質表現，進而抑制S100B蛋白質透過活化TGF-b所造成的細胞外間質堆積、細胞肥大與發炎，而過度表現的STAMP2蛋白質則能逆轉糖尿病小鼠腎絲球中與S100B蛋白質有關的分子表現。

關鍵字

S100B ； STAMP2 ； TGF-beta ； 高糖 ； 糖尿病腎病變

並列摘要

Diabetic mice had increased glomerular S100B, a ligand for receptors for advanced glycation end-product (RAGE). STAMP2 (six transmembrane protein of prostate 2, STAMP2, TIARP) is an anti-inflammatory protein. High glucose (HG) only increased IL6 expression in STAMP2-deficent adipocytes. STAMP2 knockout mice developed hyperglycemia and inflammation whereas STAMP2 overexpressing mice had decreased atherosclerosis. Thus, we studied the roles of S100B and STAMP2 in high glucose (HG)-induced effects in HG-cultured mouse mesangial (MES 13) cells and in streptozotocin-diabetic mice.
In MES 13 cells, HG increased S100B expression. HG and S100B increased cell hypertrophy, CTGF, collagen I, collagen IV, fibronectin, and TGF-b at 24-72 h. S100B increased TGF-b via ERK1/2, p38 kinase and the TGF-b receptor. HG and S100B increased transcriptional factor p65, c-Jun and co-regulated inflammation protein COX2 expression. Moreover, S100B siRNA attenuated HG-induced cell hypertrophy, collagen I, collagen IV, fibronectin, p21WAF1 and p27Kip1 expression. Finally, S100B overexpression exacerbated but antisense oligonucleotides attenuated glomerular expression of extracellular matrix proteins in streptozotocin-diabetic mice.
In MES 13 cells, HG increased cell membrane (but not cytosolic) STAMP2 via increasing S100B expression. HG increased interaction between STAMP2 and S100B. Additionally, S100B siRNA attenuated HG-induced STAMP2 protein expression via inhibiting S100B-induced JNK, Akt and Jak/STAT pathways. S100B induced STAMP2 was dependent on the STAT3-binding site in the STAMP2 promoter. Overexpression of STAMP2 attenuated HG or S100B induced p21WAF1, p27Kip1, cell hypertrophy, CTGF, collagen type I, collagen type IV, fibronectin, and pro-inflammatory proteins. Overexpression of STAMP2 attenuated HG or S100B-induced TGF-b. Overexpression of STAMP2 also attenuated HG-induced S100B and its signaling pathways. Finally, STAMP2 overexpression attenuated glomerular expression of collagen I, collagen IV, fibronectin, S100B, TGF-b, COX2, p-ERK1/2, p-Akt and p-STAT3 in streptozotocin-diabetic mice.
Conclusion: In MES 13 cells, S100B increased TGF-b via ERK1/2, p38 kinase and TGF-b receptor. HG increased pro-fibrotic proteins (TGF-??, collagen and fibronectin) via S100B and cell hypertrophy-associated p21WAF1 and p27Kip1. HG increased cell membrane (but not cytosolic) STAMP2 via S100B-induced JNK, Akt and JAK/STAT3. STAMP2 interacts with S100B. Overexpression of STAMP2 attenuated HG-induced S100B and attenuated S100B-induced TGF-b-dependent extracellular matrices, cell hypertrophy and inflammation. Finally, overexpression of STAMP2 attenuated glomerular expression of S100B-related proteins in streptozotocin-diabetic mice.

並列關鍵字

S100B ； STAMP2 ； TGF-beta ； high glucose ； diabetic nephropathy

參考文獻

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