發展具核殼結構表面增強拉曼散射標籤結合流式細胞儀之生物感測平台

Development of Raman Spectroscopy Flow Cytometry with Combination of SERS Active Nanoprobes for Highly Sensitive Online Multiplex Biosensing

劉凌璇(Ling-Hsuan Liu)

指導教授 ： 周禮君

國立中正大學/理學院/化學暨生物化學系/碩士(2014年)

摘要

摘要
細菌檢測是許多疾病治療的基礎，傳統上關於細菌感染症的診斷，主要有賴於菌體培養增殖再進行分析鑑定，例如：酵素連結免疫吸附分析法(Enzyme-Linked Immunosorbent assay, ELISA)、聚合酶連鎖反應(Polymerse Chain Reaction, PCR)等技術，過程繁瑣且費時，若無法在黃金治療時間內檢測出致病菌並正確投藥，將危及患者生命。因此，發展能夠準確及快速檢驗致病菌的方法，是現今在檢測致病菌研究方面相當重要的課題。
本研究將金奈米粒子修飾上具有獨特拉曼光譜訊號的染料分子，在其表面包覆SiO2層，製備成奈米聚集團粒子(Nanoaggregate-Embedded Beads, NAEBs)。金屬奈米顆粒之間的熱點(hot spot)使NAEBs有強烈的SERS訊號，且外層受SiO2包覆能在不同環境下保持穩定性，因此可做為SERS標籤進行光譜之鑑定。目前已成功將3,3′-Diethylthiadicarbocyanine iodide (DTDCI)、Malachite green isothiocyanate (MGITC)、Tetramethylrhodamine-5-isothiocyanate (TRITC)、Crystal violet (CV)、X-rhodamine-5-(and-6)-isothiocyanate (5(6)-XRITC)等染料分子製備成具有特定分子拉曼光譜指紋之NAEBs標籤，進而檢測及應用。
在生化應用上，快速且可靠的偵測生化分子的濃度是必要的，例如：食品安全檢驗及藥物傳遞。其中，流式細胞術 (Flow Cytometry) 為一種廣泛使用的細胞分析技術，應用於臨床醫學及生化科學領域，此技術可快速偵測一顆接著一顆於液體中流動的顆粒或是細胞。本研究設計以聚二甲基矽氧烷 (Poly(dimethylsiloxane), PDMS) 製作的十字型微流體槽道，並利用氧電漿與玻璃片以鍵結方式封裝。藉由控制兩側邊鞘流流速可將樣本流聚焦，配合共軛焦拉曼顯微鏡在偵測區做分析，具有容易操作、低成本、高通量、快速檢測以及能夠專一辨識的優點。
本研究採用PDMS製作之微流體槽道，進行各式NAEBs拉曼標籤粒子之測試，並利用不同大小的聚苯乙烯 (Polystyrene, PS) 球，分別修飾上不同的抗原以模擬細菌；再將修飾上相對應辨識分子的NAEBs與其反應，控制兩側邊鞘流將PS球聚焦流過偵測區，並利用拉曼來偵測。實驗結果顯示，各式NAEBs拉曼標籤粒子皆有相對應的抗原與抗體吸附以及拉曼光譜鑑定。最後使用真實細菌樣品沙門氏菌及奈瑟氏菌進行檢測實驗，可偵測到利用專一性鍵結上的NAEBs-MGITC和NAEBs-DTDCI之拉曼光譜訊號，藉此驗證本研究確實能夠成功對真實細菌樣品進行聚焦辨識的功能。

關鍵字

流式細胞術 ； 表面增強拉曼散射 ； 沙門氏菌

並列摘要

Abstract
Pathogen detection is the foundation of disease treatment. The current methods of pathogen detection, for instance, Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and Polymerse chain reaction (PCR), require lengthy procedures of cell culture, proliferation and detection. As a consequence, these methods tend to be tedious and time-consuming. Therefore, the development of an accurate and rapid method for analyzing pathogenic bacteria is highly desirable. In this work, we have developed a rapid, high-throughput, and specific bio-sensing platform for detecting particles or bacteria flowing one by one in a Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) microfluidic chip using confocal Raman microscopy.
We have demonstrated different Raman-labeled Nanoaggregate-embedded beads (NAEBs), each with a Raman reporter such as MGITC, TRITC, XRITC, DTDCI or CV. Furthermore, polystyrene (PS) microspheres of different sizes were used to mimic different bacteria and bio-functionalized for attachment of NAEBs. Results show that the flow cytometry-based system can identify the Surface-enhanced Raman scattering (SERS) signals of PS microspheres and bacteria when attached with Raman-labeled NAEBs.

並列關鍵字

SALMONELLA ； flow cytometry ； SERS

參考文獻

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