以CNBr-activated Sepharose 4B固定D-型胺基酸氧化酶之性質探討

Properties of D-amino acid oxidase immobilized on CNBr-activated Sepharose 4B

陳旭宏(Hsu-Hung Chen)

指導教授 ： 游吉陽

大同大學/工程學院/生物工程學系所/碩士(2008年)

摘要

D-型胺基酸氧化酶 (D-amino acid oxidase；DAO；EC 1.4.3.3)為一種FAD-dependent的酵素，會專一性催化D-型胺基酸 (D-amino acid)，在有O2的環境下，DAO會對D-amino acid受質進行氧化脫氨反應，產生α-keto acid、H2O2與NH3。DAO主要應用在生產cephalosporin之前驅物。將DAO進行固定化，以改善DAO對溫度、pH值之穩定性，以及對副產物H2O2氧化之耐受性。本論文是以CNBr-activated Sepharose 4B為固定化的載體，將Trigonopsis variabilis (TvDAO)及Rhodosporidium toruloides (RtDAO)酵素固定化後，探討溫度、pH值及H2O2對DAO固定化的影響，並與液相DAO相互比較。此外，針對動力參數、儲存穩定性、冷凍-解凍循環一併進行分析。結果顯示，在10天實驗期間的儲存穩定性方面，TvDAO固定化後於4℃儲存下，活性無明顯下降；而液相TvDAO於10天後，其相對活性為76%。RtDAO固定化後於室溫及4℃儲存下，兩者相對活性均無明顯下降，而液相RtDAO，於第10天室溫儲存下，活性即快速喪失，只剩下19%。溫度對TvDAO及RtDAO活性影響方面，TvDAO固定化後，與液相TvDAO相比，活性無顯著變化，兩者最適反應溫度皆為40℃。RtDAO固定化後，於50℃下，固定化RtDAO相對活性為72%，液相RtDAO則為34%；於60℃下，固定化RtDAO相對活性為52%，液相RtDAO則已無活性。在熱穩定性方面，TvDAO固定化後，於60℃下，固定化TvDAO相對活性為57%，而液相TvDAO則已無活性，於70℃下，兩者皆無活性。RtDAO固定化後，於50℃與60 ℃下之相對活性分別為84%及31%，而液相RtDAO則均無活性。pH對TvDAO及RtDAO活性之影響方面，TvDAO固定化後於pH 9與10時，固定化TvDAO相對活性分別為82%及71%，液相TvDAO則分別為12%及8%；RtDAO固定化後於pH 10時，固定化RtDAO相對活性為93%，液相RtDAO則為7%。TvDAO及RtDAO之H2O2耐受性方面，於180分鐘時，固定化TvDAO相對活性為99%，液相TvDAO則為4%；於270分鐘時，固定化RtDAO相對活性為97%，液相RtDAO則為17%。因此TvDAO及RtDAO在經由CNBr-activated Sepharose 4B固定化後，可明顯改善其儲存穩定性(室溫儲存下之固定化TvDAO除外)、熱穩定性、鹼性環境下之pH穩定性及H2O2的耐受性。

關鍵字

酵素固定化

並列摘要

D-amino acid oxidase (DAO; EC 1.4.3.3) is an FAD-dependent enzyme, which catalyzes the specific oxidation of D-amino acids to produce the corresponding α-keto acids with hydrogen peroxide and ammonia as by-products. The most important industrial application of DAO is the production of 7-aminocephalosporanic acid (7-ACA). In this work, DAO form Trigonopsis variabilis (TvDAO) and DAO form Rhodosporidium toruloides (RtDAO) were immobilized onto CNBr-activated Sepharose 4B. The effects of temperature, pH, and the presence of hydrogen peroxide were studied for both free and immobilized enzymes. In addition, enzyme kinetics and storage stability were also determined.

並列關鍵字

CNBr-activated Sepharose 4B ； DAO ； D-amino acid oxidase

參考文獻

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