- 學位論文
Stenotrophomonas maltophilia 誘導L1 與L2 的乙內醯胺酶動力學與受質概 論
Substrate profile and induction kinetic of L1， L2 B-lactamases of Stenotrophomonas maltophilia in a prototype model
摘要
Stenotrophomonas maltophilia 在近幾年已成為重要的院內伺機性感染 菌。因為其染色體至少有兩種 β-lactamase 基因(L1 及L2)，此為對大 部分 β-lactams 具抗性。至今，許多報告指出: L1 及 L2 基因的表現 會受 β-lactam 類抗生素誘發。本研究的材料菌株為由臨床病人分離 所得的S. maltophilia N，藉由接合作用(conjugation)；利用基因替換 方式突變(Gene replacement mutagenesis ) N 菌的 L1、L2 二基因取得 NL1-及NL2-之突變株，分別在L1、L2 二基因起始氨基酸 (Met)下游 置入一個和 L1 、 L2 二基因轉錄方向一致的報導基因, xlyE。所獲 得的 NL1- 及 NL2- 突變菌株進行兩個面向的研究: (1) L1、L2 蛋白 之受質描述 (substrate profile) : 分別藉由 agar dilution test 與 Etest 實驗測得菌株 N, NL1- 及NL2- 對13 種 β-lactam 型抗生素之最低抑 制濃度 (MIC)。藉由比較菌株 N/NL1- 與 N/NL2- 之最低抑制濃度， 而可知L1、L2 蛋白對不同受質之感受性。結果顯示 L1 酵素能水解 piperacillin、cefoxitin、cefoperazone、cefotaxime、ceftriaxone、imipenem 及meropenem ; 而L2 酵素能水解carbenicillin、cefoperazone、 cefotaxime、ceftriaxone、cefepime 及aztreonam。L1 蛋白不能水解 cefepime 及 aztreonam。(2) L1、L2 基因啟動子誘發表現之研究。第 一部份分析誘發子濃度對L1 與L2 基因誘發能力的影響。另外在比較 V cefuroxime 濃度為1、3、5、8、10、20、30、40、50、60 μg/ml 下對 L1 與L2 啟動子誘發能力的差異，可以觀察到L2 啟動子的誘發能力 與誘發子濃度有正相關性，而L1 啟動子的誘發能力則與誘發子濃度 相關不明顯。第二部份分析 NL1- 與 NL2- 菌株在50 μg/ml cefuroxime 的誘導過程中，不同時間點catechol 2,3 dioxygenase (C23O) 活性被誘發的程度。發現L1 基因在 cefuroxime 誘導的第三小時表現 最強 C23O 活性；但是之後的 C23O 活性是逐漸緩慢下降；但在相 同條件分析NL2- 的L2 啟動子C23O 活性發現，在誘導的第2.5 小 時，有了最高的活性表現且C23O 活性比L1 高出許多，但在2.5 小 時之後，L2 基因的啟動子C23O 活性則有明顯的降解，在過了第4 小時後，L2 的活性比L1 還要低，並且在第4.5 小時後降解的現象趨 於平緩。第三部份分析S. maltophilia NL1-與NL2- 在受50 μg/ml 濃度 不同種類 β-lactam 抗生素誘發下L1 與L2 啟動子C23O 的差異；發 現在所測試9 種 β -lactam 抗生素中， cefoxitin 對L1 基因的啟動子 誘發能力最大、而 cefuroxime 則對L2 基因誘發能力最大。
關鍵字
乙內醯胺酶並列摘要
Stenotrophomonas maltophilia produces two inducible β-lactamases L1 and L2, conferring resistance to a broad spectrum of β-lactam antibiotics. In this study, L1 and L2 genes and their flanking DNA regions in S. maltophilia N were obtained by PCR. An ampR gene was found to locate immediately upstream and in an opposite orientation to the L2 gene. In contrast, such a transcriptional regulator gene is absent from the upstream of L1. The xylE cassette was used to insertionally inactivate the L1 and L2 gene, generating the isogeneic mutant NL1- and NL2-, respectively. Substrate profile analysis of the L1 and L2 enzyme produced by NL2- and NL1-, respectively, revealed that L1 and L2 enzymes displayed a broad substrate profile. Induction kinetics of L1 and L2 genes were evaluated by monitoring the expressed catechol 2,3-dioxygenase activity of NL1- and NL2-. The time to reach a maximum inducibility in the presence of cefuroxime was 3 h and 2.5 h for L1 and L2, respectively. With the addition of 3 to 60 μg/ml inducer, the L2 inducibility was proportional to the inducer concentration; conversely, the inducibility of L1 was less sensitive to the concentration of inducer. Moreover, among the tested β-lactams, the most potent inducers for L1 and L2 gene were, respectively, cefoxitin and cefuroxime. The results gathered suggest that the induction of L1 and L2 genes was differentially regulated.