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研究生： 鄒宜潔
Chou, Yi-Chieh
論文名稱： 利用紫茉莉中4,5-多巴雙加氧酶之生物感測器選擇性偵測左旋多巴及二價銅離子
The Mirabilis jalapa DOPA 4,5-Dioxygenase Biosensor for Selective Detection of L-DOPA and Copper(II)
指導教授： 葉怡均
Yeh, Yi-Chun
學位類別： 碩士
Master
系所名稱： 化學系
Department of Chemistry
論文出版年： 2019
畢業學年度： 107
語文別： 中文
論文頁數： 89
中文關鍵詞： 左旋多巴 、甜菜醛胺酸 、4,5-多巴雙加氧酶 、比色法生物感測器 、螢光感測器 、銅離子
英文關鍵詞： L-DOPA, colorimetric biosensors, bioproduction
DOI URL： http://doi.org/10.6345/NTNU201900463
論文種類： 學術論文
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    • 左旋多巴為生物體內合成多巴胺的前驅物，並且為目前治療帕金森氏症最有效的藥物，因此檢測左旋多巴是一項重要的議題。在本實驗中，我們開發了一種新型的比色法生物感測器，左旋多巴在紫茉莉之4,5-多巴雙加氧酶 (MjDOD) 催化下生成黃色的甜菜醛胺酸 (具有430 nm特徵吸收峰，為甜菜色素之前驅物)，以此作為訊號來源，針對左旋多巴濃度能夠有良好的相關係數以及偵測極限 (2.8M)。本篇所開發出的系統對於偵測左旋多巴具有簡單、快速、靈敏且選擇性高等優點，同時對其他兒茶酚胺類化合物的干擾保持高度專一性，並且也利用標準添加法成功地應用於真實樣品胎牛血清中，得到良好的準確度。此外，以甜菜醛胺酸為起始物，加入一級胺類進行縮合反應生成甜菜色素，具有紅色螢光，並以其做為小分子螢光探針，能夠選擇性偵測水中的二價銅離子，並分別透過吸收與放射光譜與質譜等完成其性質鑑定，我們也成功將此系統應用於馬血清及人工尿液中，證明其穩定性和適用性。

    L-DOPA, a precursor for the biosynthesis of dopamine, is currently the most effective drug for the treatment of Parkinson's disease. Therefore, it is an important research topic to develop a quantitative method to accurately estimate the level of L-DOPA. In this study, we developed a novel colorimetric biosensor for selectively detecting of L-DOPA. L-DOPA can be catalyzed by Mirabilis jalapa dopa-dioxygenase and converted into betalamic acid (a precursor of betaxanthin and has a λmax absorption at 430 nm), which is yellow color and serves as the signal output. The detection of limit for L-DOPA was 2.8 μM. The proposed system is simple, rapid, sensitive, and selective to L-DOPA while remaining robust to interference from other catecholamines. It is successfully applied to the determination of L-DOPA in spiked fetal bovine serum samples. In addition, betalamic acid is used as a starting material, and the primary amine is added to carry out the condensation reaction to produce betaxanthin, which exhibits red fluorescence. Betaxanthin based fluorescent sensor was prepared and characterized by absorption, emission spectrum, and mass spectrometry. The proposed system can selectively detect copper(II) ion in water. We also validate the performance of this system in artificial urine and equine serum, confirming its robustness and applicability.

    口試委員會審定書 # 誌謝 i 中文摘要 ii ABSTRACT iii Abbreviations iv 目錄 vi 圖目錄 xi 表目錄 xiv Chapter 1 Introduction 1 1.1 生物感測器 (Biosensor) 1 1.1.1 前言 1 1.1.2 原理 2 1.1.3 分類 3 1.2 金屬離子感測器 (Metal ion sensor) 4 1.3 兒茶酚胺類神經傳導物質 (Neurotransmitter of catecholamine) 6 1.3.1 簡介 6 1.3.2 帕金森氏症 (Parkinson's disease) 8 1.4 甜菜醛胺酸及甜菜色素 (Betalamic acid and betalain) 9 1.4.1 甜菜醛胺酸的合成 9 1.4.2 甜菜色素的合成 10 1.5 4,5-多巴雙加氧酶 (4,5-DOPA extradiol dioxygenase) 12 1.6 酵素固定技術 (Technologies of enzyme immobilization) 14 1.6.1 簡單吸附法 14 1.6.2 基質包埋法 14 1.6.3 化學交聯法 15 1.6.4 共價鍵結法 17 1.7 螢光光譜 (Fluorescence spectroscopy) 18 1.7.1 原理 18 1.7.2 特徵光譜 19 1.7.3 螢光量子產率 20 1.7.4 螢光消光效應 (quenching effect) : 21 1.7.5 Stern-Volmer Equation 22 1.8 文獻回顧與探討 (Previous research) 23 1.8.1 左旋多巴感測器 23 1.8.2 銅離子感測器 24 1.8.3 與先前研究文獻之感測器比較 25 1.9 實驗動機與目的 26 Chapter 2 Materials and Experimental Methods 28 2.1 實驗儀器 28 2.2 實驗藥品 29 2.3 實驗設計 32 2.3.1 左旋多巴生物感測器實驗設計 32 2.3.2 銅離子感測器實驗設計 33 2.4 實驗方法 34 2.4.1 蛋白質表現、純化與定量流程 34 2.4.2 製作勝任細胞 34 2.4.3 轉化作用 35 2.4.4 4,5-多巴雙加氧酶之大量表現及純化 36 2.4.5 鎳樹脂再生 38 2.4.6 蛋白質電泳 39 2.4.7 蛋白質定量 40 2.4.8 蛋白質活性測試 41 2.4.9 MjDOD之最適pH值 42 2.4.10 MjDOD之最適輔因子 (cofactor) 濃度 42 2.4.11 酵素動力學 42 2.4.12 左旋多巴瓊脂糖凝膠感測器 43 2.4.13 甜菜色素之合成 43 2.4.14 甜菜色素用於二價銅離子之偵測 43 2.4.15 偵測極限公式計算 44 Chapter 3 Results and Discussions 45 3.1 4,5-多巴雙加氧酶之比較與純化 45 3.1.1 不同物種4,5-多巴雙加氧酶之純化 45 3.1.2 不同物種4,5-多巴雙加氧酶之動力學比較 46 3.1.3 紫茉莉4,5-多巴雙加氧酶之純化 47 3.2 實驗優化 (Experimental optimization) 49 3.2.1 pH值對MjDOD之影響 49 3.2.2 輔因子 (Cofactor) 濃度對MjDOD之影響 50 3.2.3 甜菜醛胺酸之生成時間追蹤 51 3.3 專一性測試 52 3.3.1 干擾物之吸收值比較 52 3.3.2 L-DOPA及DA動力學比較 54 3.3.3 L-DOPA與DA混合干擾測試 55 3.4 L-DOPA劑量表現之吸收值測試 56 3.5 甜菜色素之合成 58 3.5.1 使用不同胺類進行縮合之螢光光譜比較 58 3.5.2 甜菜色素之合成時間追蹤 60 3.6 L-DOPA劑量表現之螢光值測試 61 3.7 左旋多巴感測器之應用 63 3.7.1 真實樣品之檢測 63 3.7.2 左旋多巴感測器應用於瓊脂糖凝膠之測定 65 3.8 左旋多巴感測器之穩定性測試 66 3.9 使用不同胺類合成甜菜色素之顏色比較 67 3.9.1 不同胺類取代基之螢光探討 67 3.9.2 不同相位羧基生成甜菜色素之螢光探討 69 3.10 甜菜色素之質譜鑑定 71 3.11 甜菜色素用於二價銅離子之偵測 73 3.11.1 金屬離子選擇性測試 73 3.11.2 不同相位羧基之甜菜色素加入銅離子後螢光猝滅現象 74 3.11.3 甜菜色素與二價銅離子反應之螢光淬滅時間追蹤 75 3.11.4 銅離子之劑量反應測試 76 3.11.5 不同pH之探討 78 3.11.6 不同溫度之探討 79 3.11.7 加入EDTA探討螢光回復性 80 3.11.8 銅離子感測器之應用 82 3.12 優化參與甜菜色素反應之一級胺類濃度 84 Chapter 4 Conclusions 85 REFERENCE 86 附錄 本研究中所使用之引子、菌種與質體 88

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    2024/07/31
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