清華大學化學工程學系學位論文
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摘要 近年來高分子微胞藥物載體在藥理上的開發與應淤備受期待，如何能使微胞更穩定於體內循環是現今重要課題之一。 為了將低高分子的臨界微胞濃度，以提升其在人體內穩定度，並且讓Enchanced Permeability and Retention Effect發揮最大功效，本研究設計與合成具有酸鹼應答、生物相容性及生物可降解之接枝共聚物(P(His-co-HPMA-co-HPMA-Lac2)-g-PLA)，以及具有免疫隱蔽性及生物可降解性之二團聯共聚物mPEG-PLA，共同製備具有高血液穩定性之複合型奈米微胞，以作為抗癌藥物Doxorubicin之藥物載體，並進而探討此劑型於肺癌治療之效用。 研究首先合成一系列不同比例(L0~L4)及(S0~S4)之接枝共聚物，並探討不同組成重量比下接枝共聚物/雙團聯共聚物對於複合型微胞粒徑及分佈之影響，結果顯示當接枝共聚物(L3)/雙團聯共聚物(B)重量比例為1:2時，以有機溶劑DMSO包覆藥物Doxorubicin，初期含水量為20%時，所形成複合型奈米微胞粒徑約243.8nm、粒徑分佈約為0.205且藥物包覆率為16.06%，適合用於動物體內之藥物傳輸。經由上述研究之最佳條件下，複合型奈米微胞導入Cy5.5-PEG-PLA以作為癌症組織之「顯影」功能，用以觀測癌細胞之毒殺與胞飲行為，以及動物實驗之微胞分佈與癌症治療情形。 經由體外藥物釋放模擬實驗證實複合型藥物微胞於中性環境pH7.4下可以穩定地將藥物包覆。而在酸性環境pH5.4、pH4.5下微胞結構對環境產生應答(膨潤)可將藥物釋放出，並呈穩定釋放的效果。在材料細胞毒性研究中可知，複合型奈米微胞由於結構組成皆為FDA 核可，故毒性較低。由藥物載體毒殺Hela、LL/2、ES2細胞之MTT結果，L3B之24小時和72小時之IC50差異很大，而S3B在24小時和72小時之IC50差異不大，証明L3B結構在24小時後鬆散釋放出藥物。 以共軛焦顯微鏡觀測藥物及複合型奈米微胞藥物分佈情形發現，複合型奈米藥物微胞隨著時間增加，藥物微胞經由進入細胞內慢慢累積在癌細胞，於酸性胞器中釋放藥物後，藥物則累積於細胞核部分。 在動物實驗中以optical imaging (2-D Near-IR)觀測複合型微胞在不同時間下於動物體內之累積量及分佈情形，實驗顯示複合型奈米藥物微胞經由EPR效應後其藥物微胞累積在腫瘤組織大於其他器官。 在動物實驗中觀測複合型奈米藥物微胞於動物體治療腫瘤情形，實驗得知以具酸鹼應答之複合型奈米微胞包覆Doxorubicine具有較低的毒性且相較於free dox及control實驗組有較好的腫瘤抑制效果。 綜合本研究所得之結果，複合型奈米藥物微胞不論於細胞毒性研究或動物實驗均證實極具癌症治療效果。未來可運用微胞具標識腫瘤組織的功能，診斷癌症組織之分佈位置，早期於癌細胞擴散前追蹤與治療，並且於治療時能更精準的殺死癌細胞，有效達到抗癌效果，促進人類醫療福祉，對癌症治療醫學上作出重大貢獻。 Abstract Long-blood circulation mixed micelles that constructed from P(His-co-HPMA-co-HPMA-Lac2)-g-PLA and diblock copolymer PEG–PLA with was developed in this study. Stability analysis of the mixed micelles in bovine serum albumin (BSA) solution by DLS indicates that the diblock copolymer mPEG protected efficiently the BSA adsorption on the mixed micelles. Moreover, mixed micelles could keep the size and PI stable above 120 hr because the hydrophobic groups of graft copolymer could solidify inner core and mPEG offered the stability to the drug carrier as well as avoiding them recognized by mononuclear phagocytesystems (MPS). The mixed micelles had well defined core shell structure which was evaluated by TEM. The functional inner core of P(His-co-HPMA-co-HPMA-Lac2)-g-PLA exhibited pH and hydrolysis stimulate to enable intracellular drug delivery and outer shell of PEG-b-PLA with functional moiety Cy5.5 for biodistribution diagnosis at the end of the polymer chain. The graft and diblock copolymer self assembled to empty nanospheres against water with an average diameter below 120 nm, and an average diameter of around 243.8nm when loaded with doxorubicin. From drug released study, a change in pH swollen and destroy the structure of the inner core from that of graft copolymer P(His-co-HPMA-co-HPMA-Lac2)-g-PLA, keeped the release of a significant quantity of doxorubicin (Dox) from mixed micelles. Fluorescence images of multifunctional micelles by confocal laser scanning microscopy (CLSM) indicated that most of the anticancer drug and carriers were localized in nucleus and cytoplasm because of the colocalization of fluorescence with that from doxorubicin and Cy5.5. Encapsulation of doxorubicin in long-blood circulation mixed micelles increased its internalization by MDR LL/2 cells into lysosomes and enhanced cytotoxicity. The in vivo antitumor efficiency experiment revealed that high stable mixed micelles are effective in inhibiting tumor growth in the subcutaneous MDR LL/2 tumor model. To the best of our knowledge,, multifunctional micelles prepared from P(His-co-HPMA-co-HPMA-Lac2)-g-PLA, PEG–PLA and Cy5.5 PEG–PLA had great potential in cancer chemotherapy and diagnosis.
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此研究使用0.1 wt% Pt/Al2O3 與Pt/TiO2-ZrO2觸媒，在bench scale固定床反應器內進行氫化反應，其溫度為200-250 ℃、壓力為450 psi、H2/HC=6。由四氫萘的擬一次反應式求得反應速率常數，來比較氫化活性。結果顯示Pt/TiO2-ZrO2觸媒在含硫及不含硫條件下，均擁有較高的氫化活性。我們改變硫含量，由0 ppm 至50 ppm，發現反應速率常數和硫含量成反比，藉由Langmuir-Hinshelwood 模型，我們解釋現象並進一步求得硫的吸附平衡常數，Pt/TiO2-ZrO2與Pt/Al2O3的平衡常數分別為7×106 和2×107。另外在含硫條件下仍遵守亞倫尼亞 (Arrhenius) 方程式，由含硫及不含硫條件下的外顯活化能 (Apparent Activity Energy)，我們進一步求得硫的吸附熱(Heat of adsorption of sulfur)，Pt/TiO2-ZrO2與Pt/Al2O3的吸附熱分別為-19.4 kJ/gmol和-41.0 kJ/gmol。相對反應速率常數顯示Pt/TiO2-ZrO2觸媒擁有較高的抗硫性，由硫的吸附平衡常數與硫的吸附熱可以得知，吸附於擔載TiO2-ZrO2的白金的硫較容易脫附。可能因為其TiO2-ZrO2擔體的酸性引發白金的缺電子性，以及擔體可產生較多溢流的氫。此外，Pt/TiO2-ZrO2在15 ppm含硫進料進行反應時，產物中含硫量不到1 ppm，顯示其不但擁有高抗硫性還有脫硫的功能。
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摘要 由於商業鹼製程在轉酯化反應的過程中，會受限於原料中的水分及游離脂肪酸，而產生皂化作用，使產率下降；且於製程中需加入液體觸媒，而使得轉酯化反應後的產物須經過水洗中和鹼液，所產生的廢液會增加分離純化的困難度並造成環境的污染。另一方面，轉酯化的原料大多是由動植物油脂而來，因此若要大量發展生質柴油，勢必會產生原料缺乏的情況，所以須選擇無競爭性的油脂，以減低原物料缺乏的風險並維持穩定的供應鏈。 為改善鹼製程的缺失，本研究以不可食用的麻瘋油與甲醇為原料，在超臨界甲醇的條件下，於連續式管狀反應器中進行轉酯化反應，且亦於反應器中填入固體觸媒及添加共溶劑，促進醇油間的接觸及混合，以減少製程的能耗並加速轉酯化反應的進行。藉由獲得轉酯化反應的產率，可得到最適操作條件；此外，亦可求出動力式參數，以作為日後放大設計之依據。 實驗結果顯示，在操作溫度為280℃、壓力為2000 psi、醇油莫耳比為24及滯留時間為20分鐘時，以填充氧化錳觸媒進行轉酯化反應；與未填充觸媒時相比，甲基酯產率由20%左右，大幅提升至99%以上，且在觸媒作用下，可縮短滯留時間於11分鐘，即可達到穩定的高產率；另一方面，添加乙醚共溶劑於轉酯化系統，在操作壓力為2000 psi、醇油莫耳比為12、滯留時間為5.5分鐘，乙醚與甲醇的莫耳比為0.1下，發現在溫度260℃以上，甲基酯產率有些微的成長，與觸媒催化的效果相比，共溶劑促進反應速率的影響是非常微弱的。 在動力學方面，藉由一階線性方程式進行轉酯化反應之擬合結果，於填充觸媒下，反應的活化能由5686 (J/mol K)降至3063(J/molK)，有明顯的下降；而由求得之指前因子及活化能代回反應之動力式，可得知於填充觸媒下之轉酯化反應動力式為-r(TG)=185 exp((-3063)/RT)C_A^ 。
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摘要 大範圍骨缺陷通常不易痊癒且治療方式複雜，牽涉到許多困難的外科手術。近來，結合病毒基因載體與間葉幹細胞療法發展出之新穎技術，已顯示可協助並加速骨修復。其中脂肪幹細胞(ADSCs)由於容易分離培養，近來亦受到廣泛研究應用。本研究目的探討藉由FLP/Frt基因延長表現系統之新型重組桿狀病毒轉導ADSCs後是否可以加速修復大範圍骨缺陷。首先利用帶有FLP/Frt系統的基因重組桿狀病毒Bac-FCBW(表現第二型骨型態蛋白(BMP2))及Bac-FCVW(表現血管內皮細胞生長因子(VEGF))轉導ADSCs，觀察表現BMP2或VEGF能力。結果顯示，帶有FLP/Frt表現系統的新型桿狀病毒，可延長基因表現達到28天以上，並可有效促使ADSCs往硬骨細胞分化。我們將轉導過不同重組桿狀病毒的ADSCs混合種入PLGA載體並移植入紐西蘭白兔股骨缺陷(critical-sized femora bone defect)以評估加速骨缺陷修復的效果。X-ray結果顯示，實驗組(植入帶有FLP/Frt系統之ADSCs)不僅可於植入2週時間後，形成新骨連結骨缺陷；並且在植入4週時間後，所有動物皆完成骨缺陷修復(N>6)。另外藉由正子斷層(PET)，電腦斷層(CT)掃描，H&E染色與機械應力測試，亦發現與對照組(植入假性轉導或CMV啟動子表現之BMP2, VEGF)比較，混合移植經Bac-FCBW與Bac-FCVW轉導之ADSCs確實可加速大範圍骨缺陷修復。這些實驗結果顯示，結合FLP/Frt延長表現系統之新型桿狀病毒基因治療與ADSCs，可作為大範圍骨缺陷重建的另一選擇。
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血管新生作用與實體腫瘤進一步的發展有著密切關係，而且在許多與癌症相關的疾病中，抗血管新生的療法具有良好的抑癌效果。在本研究中，我們利用桿狀病毒載體將人類endostatin和angiostatin複合蛋白 (hEA) 基因直接送入腫瘤細胞中，並結合Sleeping Beauty (SB) 基因轉位系統來達到長期抑制腫瘤所誘發的血管新生。首先，我們建立三株重組桿狀病毒：Bac-hEA/w是以巨細胞病毒早期啟動子來驅動hEA的表現，並且在hEA基因下游插入土撥鼠肝炎病毒後轉錄調節序列來增強治療蛋白的表現量；Bac-SB-T2-hEA/w是在上述基因表現匣兩端接上反向重複序列，以完成SB轉位子的建構，並將SB轉位酶基因表現匣構築在同一株病毒；Bac-SB-T2-luc/w是將Bac-SB-T2-hEA/w中的hEA基因以luciferase基因取代之。由動物實驗結果可知在施打病毒後前期，桿狀病毒載體本身具有顯著的抗腫瘤效果，但不會減少腫瘤血管數；因為hEA的長期表現能有效抑制腫瘤所誘發的血管新生 (p < 0.05) ，因此能更有效地延緩腫瘤生長。
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桿狀病毒已被證實可作為基因載體應用於間葉幹細胞之基因改質。然而桿狀病毒在哺乳動物細胞內不會進行複製，且病毒基因體和選殖基因會隨著細胞的增生，逐漸被稀釋和分解，造成轉殖基因表現期較短。因此本實驗室先前發展了一套具備長期穩定表現轉殖基因的系統，以BacFLP帶有特定點重組酶(Capone et al.) FLP基因，對BacCON-CE的Frt 序列間基因，進行催化反應，協助Frt 序列間的基因重組，形成存在於染色體的游離型態質體，並藉由來自EBV的oriP/EBNA1基因使之隨細胞依同複製。此系統可成功延長轉殖基因表現，並加速刺激幹細胞往硬骨分化，說明長效型桿狀病毒具有骨修復的潛能。為利於長效型重組桿狀病毒日後之發展及應用，本研究的目的為評估長效型桿狀病毒的安全性。我們利用BacFLP及BacCON-CE共同轉導人類間葉幹細胞，並未影響細胞存活及細胞生長速率。再者經長效型桿狀病毒轉導之間葉幹細胞由染色及Q-RT-PCR分析後，證明仍然可往脂肪、硬骨及軟骨分化。以PCR及FISH分析episomal及chromosomal DNA的結果，可發現長效型重組桿狀病毒基因及外源基因不會嵌入至轉導後細胞的染色體中。此外利用Karyotype、qRT-PCR及western blot分析轉導後之人類間葉幹細胞，發現並無染色體對數及結構之缺失或改變，且在抑癌及致癌基因上也沒有過度活化的表現。綜合上述，我們可知長效型重組桿狀病毒為一個安全有效的系統。
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In this study, a novel and fast cathodic deposition process is developed to fabricate a titanium dioxide thin film from an aqueous solution containing titanium trichloride and excess sodium nitrate. The reaction mechanism is studied by linear sweep voltammetry (LSV), cyclic voltammetry (CV), and electrochemical quartz crystal microbalance (EQCM). It is found that the redox reaction NO3 and Ti3+ in the precursor solution accelerates the cathodic deposition of TiO2 thin film drastically. The Ti to O ratio of as-prepared thin film is confirmed to be 1 to 2 by high-resolution X-ray photoelectron spectroscope (HRXPS). Besides, the surface morphologies and crystalline phase are characterized by field-emission transmission electron microscopic (FETEM), field-emission scanning electron microscopic (FESEM), X-ray diffraction (XRD) and atomic force microscope (AFM). The surface morphology of the as-prepared deposit plated at room temperature has been confirmed to be rough and porous, which is mainly full of micropores from the BET results of nitrogen adsorption/desorption isotherms. This study also demonstrates that the microstructure of TiO2 film can be designed and controlled by adjusting the temperature and cycle number of cathodic deposition in the previous, specially designed solution. The poor electron conductivity of TiO2 depresses the generation rate of OH from the reduction of NO3 and N2, reducing the TiO2 deposition rate. The morphology and size of TiO2 aggregates are strongly influenced by varying the deposition temperature from 5 to 50 oC. A maximal rate of TiO2 deposition is obtained at 25-35 oC because a higher OH concentration favorable for TiO2 formation and more N2 bubbles crowding out TiO2+ and TiO2 primary particulates occur simultaneously at the cathode surface vicinity with increasing the bath temperature. TiO2 deposited at 25 oC is roughest with roughness factor (Ra) = 66.847 nm. This study provides a useful method to control the morphology and deposition rate of TiO2 film for practical applications. Besides, in this work, two different annealing strategies: annealing in air and microwave-assisted hydrothermal annealing (MAHA) on the crystallinity of TiO2 deposits were compared. A novel and promising strategy is proposed for obtaining well-crystalline TiO2 in the anatase phase (A-TiO2) at a low annealing temperature of 150 oC in a very short annealing time. The porous titanium dioxide films were treated by the MAHA process to increase the crystal size of A-TiO2 at 150 oC. Through FESEM and FETEM analyses, the morphology of TiO2 particles remains grainy without obvious size change. From selected-area electron diffraction (SAED) and Raman characterization, the amorphous as-deposited TiO2 films were effectively transformed into crystalline TiO2 of the anatase phase in the MAHA environment at 150 oC. Effects of the applied power density and MAHA time on the A-TiO2 crystal size at 150 oC were preliminarily investigated. TiO2 with the best crystalline quality was obtained under an applied power density of 120 W for 2 min, very similar to A-TiO2 annealed in air at 300 oC for 1 hr.
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本研究以氯化亞錫和硫化鈉為反應物，分別於水相使用以靜電排斥分散的3-Mercaptopropionic acid(MPA)分散劑以及於乙二醇中使用油酸(oleic acid，OA)作為分散劑，製備硫化亞錫奈米微粒並研究晶相(XRD)、粒徑分佈及表面結構(TEM、SEM以及雷射動態粒徑儀)、吸收光譜(UV-vis)等特性。 以MPA作為分散劑可以得到越鹼的鹼性環境下其硫化亞錫的分散性越好，實驗中發現以MPA:Sn:S莫耳比為4:1:1於pH 8.5下分散的硫化亞錫奈米微粒，可以得到粒徑小於10 nm的顆粒，但由於表面結構不穩定產生溶解，使得顆粒大小不均，為改善硫化亞錫溶解的情形，實驗以硫化鋅包覆的硫化亞錫奈米微粒可以有效提升吸收性質(未經處理的硫化亞錫奈米微粒從650 nm波長開始吸收，而經過包覆硫化鋅後硫化亞錫奈米微粒從800 nm波長開始吸收)，但穩定性改善有限。於乙二醇下製備之硫化亞錫奈米微粒粒徑為20 - 40 nm，將製備之硫化亞錫奈米微粒，經過離心清洗後，添加MPA作為水相分散劑，可以分散於鹼性環境下的水溶液，利用乙二醇溶劑製備之優點可以避免硫化亞錫於製備中產生溶解，使粒徑分佈較為一致。 利用硫化鋅量子點為核種取代生成硫化亞錫奈米微粒，製備MPA:Zn:Sn:S莫耳比為6:1:1.5:1、6:1:1:1以及6:1:0.75:1三組所得到之顆粒粒徑皆為20 - 30 nm，此方法獲得的粒徑較為均勻，表面結構較為穩定，吸收性質同樣獲得改善。
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本研究藉由一系列矽烷化合物(Silane) 經溶膠-凝膠反應對硝酸/硫酸處理過之奈米碳管進行表面改質，以提升其在溶劑中的分散穩定性，並利用紅外線光譜與拉曼光譜對矽烷化合物改質之奈米碳管進行結構鑑定。另外，利用電子顯微鏡、穿透式電子顯微鏡、比表面積分析儀、表面電位分析儀與穿透度量測對矽烷化合物改質之奈米碳管進行分散穩定性分析，經上述分析結果顯示，帶有辛基的矽烷化合物改質之奈米碳管在不同極性之溶劑中皆具有最佳分散穩定性。 因此，將辛基矽烷化合物改質之奈米碳管與聚甲基丙烯酸甲酯依不同比例製備成網印材料，並利用微差掃描卡計與熱重損失分析儀分析其熱性質，結果顯示，當辛基矽烷化合物改質之奈米碳管在聚甲基丙烯酸甲酯中的含量增加時，複合材料的熱穩定性也隨著提高。另外，亦以動態機械分析儀量測複合材料的機械性質，結果顯示，複合材料的抗拉強度也隨著辛基矽烷化合物改質之奈米碳管在聚甲基丙烯酸甲酯中含量的增加而提高。以電子顯微鏡與原子力顯微鏡分析複合材料網印後的表面形態與分散性，結果顯示，3 wt%辛基矽烷化合物改質之奈米碳管在聚甲基丙烯酸甲酯中具有最佳的分散效果，在將其製做成二極結構奈米碳管場發射顯示器，利用超高真空陣列測試器進行場發射特性分析時發現，添加3 wt%辛基矽烷化合物改質之奈米碳管於聚甲基丙烯酸甲酯中具有較佳的發光均勻性及較低的驅動電場1.9 V/μm，且在固定電場下，具有較大的電流值。 最後為了改善三極結構奈米碳管場發射陰極板製作精度，本研究利用水平旋轉噴灑蝕刻機制，讓蝕刻液經由噴嘴由下往上噴灑，提高蝕刻速率，減少殘留，使蝕刻孔洞的形狀接近於非等向性蝕刻。製程參數最佳化實驗中得到，當顯影液濃度為 2.2 wt%，噴壓1034 Pa時可以得到最大的蝕刻因子為0.7737，蝕刻圖形的均勻性為94 %。在三極結構中，控制陽極電壓為1500 V，閘極電壓為100 V，可得到電流強度為10 mA，發光均勻度為83.85 %。
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以往分子動力模擬對於有帶電粒子系統較不易處理，主要是因為靜電力的收斂緩慢，若強制使用截斷半徑則會對力的計算上產生相當大的誤差。所幸藉由Ewald sum來處理靜電力，可得到合理的計算結果。但是Ewald sum方程式複雜，因此須先得到正確的作用力處理式才能夠運用於分子動力模擬中。 本研究可分為三個部份： I.首先推導出Ewald sum以得到正確的計算式，接著驗證Ewald sum程式 化過程無誤。 II.將成功得到的計算式運用於分子動力模擬-建立純水系統。 III.最後建立鹽類水溶液。 研究最後探討各種離子對與不同的濃度對於水分子間氫鍵的影響，結果發現離子對於水分子間氫鍵的破壞與離子的水合能力是成正比關係。
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